Untersuchung der kompartimentspezifischen Caspase-Aktivierung und Organellschädigung in insulinproduzierenden Zellen durch proinflammatorische Zytokine

Fragestellung: Der Typ 1 Diabetes mellitus ist die Folge eines Autoimmunprozesses, der zur selektiven Zerstörung der pankreatischen β-Zellen führt. Dabei spielen verschiedene kompartimentspezifische Aktivierungen intrazellulärer Signalkaskaden durch proinflammatorische Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies eine zentrale Rolle. In früheren Studien konnte in insulinproduzierenden RINm5F-Zellen, die Katalase in Mitochondrien überexprimieren (MitoKat), eine erniedrigte Caspase-9 Aktivierbarkeit durch Zytokine beobachtet werden. Daher war das Ziel dieser Studie, die Wechselwirkungen von zytokininduziertem ER Stress, mitochondrialer Apoptoseinitiierung und oxidativer DNA-Schädigung zu charakterisieren.

Methodik: Die Quantifizierung der Caspase-9 und -12 Aktivität in insulinproduzierenden RINm5F-Kontrollzellen sowie in Katalase überexprimierenden Zellen (zytosolisch (CytoKat) und mitochondrial (MitoKat) lokalisiert) wurde mittels Durchflusszytometrie nach 24stündiger Inkubation mit IL-1β oder mit einem Zytokinmix (IL-1β, TNF-α und IFN-γ) ermittelt. Um die Bedeutung der ER-spezifischen Caspase-12 in dem zytokinvermittelten β-Zelltod aufzuklären, wurden die Zellen zusätzlich mit dem spezifischen Caspase-12 Inhibitor Z-ATAD-FMK behandelt. Die Zellvitalität wurde mittels MTT-Assay, die oxidative DNA Schädigung mit 8-Oxyguanin als Biomarker in einem fluoreszenzbasierten Assay nach einer 72stündigen Zytokinexposition erfasst.

Ergebnisse: Die Exposition von RINm5F-Kontrollzellen mit Zytokinen führte im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu einem signifikanten Anstieg der Caspase-9 und Caspase-12 Aktivität. MitoKat und CytoKat überexprimierende Zellen zeigten dabei eine vergleichbare Aktivierung der ER-spezifischen Caspase-12, wobei die MitoKat-Zellen im Vergleich zu den Kontroll- und CytoKat-Zellen eine signifikant erniedrigte Caspase-9 Aktivität aufwiesen. In Gegenwart des Caspase-12 spezifischen Inhibitors war die Caspase-12 Aktivität im Vergleich zu den unbehandelten Zellen signifikant erniedrigt. Dabei zeigte die Inhibierung der Caspase-12 keinen Einfluss auf die Caspase-9 Aktivität und die Zellvitalität. Die Zytokinexposition von Kontrollzellen mit und ohne Caspase-12-Inhibitor führte zu einer signifikanten Abnahme der Zellvitalität. Eine zytokinvermittelte Induktion der oxidativen DNA-Schädigung konnte ebenfalls in den Kontroll- und CytoKat-Zellen beobachtet werden, während in MitoKat-Zellen keine signifikant erhöhte oxidative DNA-Schädigung detektierbar war.

Schlussfolgerungen: Diese Ergebnisse zeigen, dass der mitochondriale Apoptoseweg für den zytokinvermittelten β-Zelltod ausschlaggebend ist, während eine Inhibierung der durch ER-Stress aktivierten Caspase-12 das Ausmaß der β-Zellzerstörung nicht verringerte. Diese Resultate ermöglichen eine genauere Aufklärung und Differenzierung der zytokininitiierten Signalkaskaden, die einen zentralen Ansatzpunkt zum Schutz von β-Zellen vor einer Autoimmunzerstörung im Typ 1 Diabetes mellitus darstellen.