Within-Gene Interaction Between c.135 G/A Genotypes and RET Proto-Oncogene Germline Mutations in HSCR Families

Abstract

Hirschsprung disease (HSCR) is considered a model for a complex inheritance disorder. Several genes, including the major HSCR-susceptibility RET proto-oncogene, play an aetiological role in the development of HSCR. Genetic linkage analysis in familial HSCR with both long- and short-segment phenotypes has demonstrated a tight linkage to the RET locus, while the phenotype within a HSCR family is characterised by an incomplete penetrance or a variable extension of the aganglionosis. Therefore, additional genetic alterations of RET are postulated in the aetiology or modification of the HSCR phenotype.

In this study, the coding region of all 21 exons of the RET proto-oncogene, including the flanking intronic sequences, were investigated by direct DNA sequencing in a HSCR population. We genotyped the c.135 G/A polymorphism and resolved haplotypes comprising the mutation locus and the c.135 G/A polymorphism.

Twenty different mutations were detected in 18 of 76 HSCR patients. In ten families the mutations were inherited from the parents, while only four patients had a positive family history for the disease. Moreover, in all ten families an incomplete penetrance of the HSCR phenotype was observed. We have investigated the effect of the non-mutated wild-type allele as well as the c.135 G/A polymorphism on the phenotype within the HSCR families.

Our findings support the notion that both RET alleles are involved in the pathogenesis of a subgroup of HSCR patients in a dose-dependent fashion. Additionally, we have shown a modifying effect of the c.135 G/A polymorphism on the HSCR phenotype within HSCR families.

Résumé

La maladie de Hirschsprung (HSCR) peut être considérée comme se transmettant suivant un mode héréditaire complexe. Plusieurs gènes, y compris le gène majeur de la maladie de Hirschsprung ou RET-proto-oncogène, semblent jouer un rôle étiologique important dans le développement de l'HSCR. L'étude des liens génétiques des phénotypes à segments longs et à segments courts au sein de l'HSCR familial a démontré une corrélation étroite avec le locus RET.

Mais le phénotype au sein d'une famille HSCR est caractérisé par une pénétrance incomplète ou un développement variable de l'aganglionose. Ceci suggère des facteurs génétiques additionnels qui pourraient modifier la génèse ou le phénotype du HSCR.

Dans cette étude, la région codifiante de tous les 21 exons du RET proto-oncogène, y compris les séquences bordantes introniques, a été étudiée par séquencement direct de DNA au sein d'une population HSCR.

Nous avons analysé le polymorphisme du c. 135 G/A et développé des haplotypes comprenant la mutation probable du locus ainsi que le polymorphisme du c.135 G/A.

Vingt mutations différentes ont été identifiées parmi 18 des 76 patients HSCR. Au sein de 10 familles, la mutation fut déjà héritée des parents, mais uniquement chez 4 familles de patients la maladie s'est manifestée. De plus, chez toutes les familles, une pénétrance incomplète du phénotype HSCR a été observée.

Nous avons étudié au sein des familles HSCR l'influence d'allèles sauvages non-mutées ainsi que le polymorphisme du c.135 G/A sur le développement de la maladie.

Nos observations supportent la notion que les deux allèles RET sont impliquées dans la pathogénèse de la maladie, tout au moins chez une partie des patients HSCR, selon un mode dose-dépendant. De plus, nous avons montré un effet du polymorphisme du c. 135 G/A modifiant le phénotype au sein des familles HSCR.

Resumen

La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es considerada como un modelo de herencia compleja. Varios genes juegan un papel en la etiología y desarrollo de la HSCR incluyendo el proto-oncogen RET. Estudios de asociación genética en HSCR familiar han demostrado una unión muy estrecha con el locus RET mientras que el fenotipo dentro de una familia HSCR se caracteriza por una penetrancia incompleta o una extensión variable del aganglionismo. Por este motivo se han propuesto otras alteraciones genéticas del RET en la etiología o modificación del fenotipo de la HSCR. En este estudio hemos investigado por secuenciación directa de DNA en una población HSCR la región codificante de los 21 exones del proto-oncogen RET incluyendo las secuencias intrónicas vecinas. Genotipamos el polimorfismo c.135G/A y resolvimos los haplotipos que incluían el locus de la mutación y del polimorfismo c.135G/A. Detectamos 20 mutaciones diferentes en 18 de 76 pacientes con HSCR. En 10 familias las mutaciones se heredaron de los padres mientras que solamente 4 pacientes tenían historia familiar. Además, en las 10 familias observamos una penetrancia incompleta del fenotipo HSCR. Investigamos el efecto del alelo no mutado así como el polimorfismo c.135G/A en el fenotipo dentro de las familias HSCR.

Nuestros hallazgos refuerzan el concepto de que ambos alelos RET están implicados en la patogenia de un subgrupo de pacientes con HSCR de manera dosis-dependiente. Además mostramos un efecto modificador del polimorfismo c. 135G/A en el seno de las familias HSCR.

Zusammenfassung

Der Morbus Hirschsprung (HSCR) wird als Modellerkrankung für einen komplexen Vererbungsmodus angesehen. Einschließlich des RET-Protoonkogens - dem Hauptgen für den HSCR - haben mehrere Gene eine ätiologische Bedeutung für die Genese der Erkrankung. Kopplungsanalysen in HSCR-Familien mit kurz- oder langstreckigen aganglionären Segmenten zeigten eine enge Kopplung zum RET-Genort. Aber die Ausprägung der Erkrankung innerhalb der Familien ist durch eine inkomplette Penetranz oder Schwere der Aganglionose geprägt. Daher werden weitere genetische Faktoren angenommen, die die Genese oder den HSCR-Phänotyp modifizieren.

In dieser Studie ist die kodierende Region aller 21 Exons des RET-Protoonkogens einschließlich der flankierenden Intronabschnitte mittels direkter DNA-Sequenzierung in einer Morbus-Hirschsprung-Population untersucht worden. Es wurden der c.135 G/A Polymorphismus analysiert und Haplotypen gebildet, die den c.135 G/A Polymorphismus und den Genort einer möglichen Mutation enthalten.

Zwanzig verschiedene Mutationen wurden in 18 von 76 HSCR-Patienten identifiziert. In zehn Familien ist die Mutation bereits von den Eltern vererbt worden, aber bei nur vier Patienten bestand eine Familienanamnese hinsichtlich der Erkrankung. Außerdem war in allen zehn Familien eine inkomplette Penetranz der Erkrankung zu beobachten. Es wurde der Effekt des nicht mutierten Wildtyp-Allels und des c.135 G/A Polymorphismus auf die Ausprägung der Erkrankung innerhalb der Familien untersucht.

Unsere Beobachtungen geben einen Anhalt dafür, dass die RET-Allele beider Chromosomen eine Bedeutung für die Entstehung der Erkrankung zumindest bei einem Teil der HSCR-Patienten im Sinne eines Dosis-Effektes haben. Außerdem zeigen wir einen den Phänotyp modifizierenden Effekt des c.135 G/A Polymorphismus innerhalb der HSCR-Familien.

Familial Hirschsprung disease - RET germline mutation - polymorphism - penetrance

Maladie de Hirschsprung familiale - mutation RET - polymorphisme - pénétrance

Enfermedad de Hirschsprung familiar - mutaciones de RET en la linea germinal - polimorfismo - penetrancia

Familiärer Morbus Hirschsprung - RET-Keimbahnmutation - Polymorphismus - Penetranz

References

• 1 Auricchio A, Griseri P, Carpentieri M L, Betsos N, Staiano A, Tozzi A, Priolo M, Thompson H, Bocciardi R, Romeo G, Ballabio A, Ceccherini I. Double heterozygosity for a RET substitution interfering with splicing and an EDNRB missense mutation in Hirschsprung disease.  Am J Hum Genet. 1999;  64 1216-1221
• 2 Bolande R P. The neurocristopathies: a unifying concept of disease arising in neural crest maldevelopment.  Hum Pathol. 1974;  5 409-429
• 3 Bolk S, Pelet A, Hofstra R WM, Angrist M, Salomon R, Croaker D, Buys C HCM, Lyonnet S, Chakravarti A. A human model for multigenic inheritance: phenotypic expression in Hirschsprung disease requires both the RET gene and a new 9 q31 locus.  Proc Natl Acad Sci USA. 2000;  97 268-273
• 4 Bolk Gabriel S, Salomon R, Pelet A, Angrist M, Amiel J, Fornage M, Attie-Bitach T, Olson J M, Hofstra R, Buys C, Steffann J, Munnich A, Lyonnet S, Chakravarti A. Segregation at three loci explains familial and population risk in Hirschsprung disease.  Nature Genet. 2002;  31 89-93
• 5 Borrego S, Saez M E, Ruiz A, Gimm O, Lopez-Alonso M, Antinolo G, Eng C. Specific polymorphisms in the RET proto-oncogene are over-represented in patients with Hirschsprung disease and may represent loci modifying phenotypic expression.  J Med Genet. 1999;  36 771-774
• 6 Brandi M L, Gagel R F, Angeli A, Bilezikian J P, Beck-Peccoz P, Bordi C, Conte-Devolx B, Falchetti A, Gheri R G, Libroia A, Lips C JM, Lombardi G, Manelli M, Pacini F, Ponder B AJ, Raue F, Skogseid B, Tamburano G, Thakker R V, Thompson N W, Tomasetti P, Tonelli F, Wells Jr S A, Marx S J. Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2.  J Clin Endocrinol Metab. 2001;  86 5658-5671
• 7 Buchin P J, Levy J S, Schullinger J N. Down's syndrome and the gastrointestinal tract.  J Clin Gastroenterol. 1986;  8 111-114
• 8 Cosma M P, Cardone M, Carlomagno F, Colantuoni V. Mutations in the extracellular domain cause RET loss of function by a dominant negative mechanism.  Molec Cell Biol. 1998;  18 3321-3329
• 9 Doray B, Salomon R, Amiel J, Pelet A, Touraine R, Billaud M, Attié T, Bachy B, Munnich A, Lyonnet S. Mutation of the RET ligand, neurturin, supports multigenic inheritance in Hirschsprung disease.  Hum Mol Genet. 1998;  7 1449-1452
• 10 Fitze G, Schreiber M, Kuhlisch E, Schackert H K, Roesner D. Association of RET protooncogene codon 45 polymorphism with Hirschsprung disease.  Am J Hum Genet. 1999;  65 1469-1473
• 11 Fitze G, Cramer J, Ziegler A, Schierz M, Schreiber M, Kuhlisch E, Roesner D, Schackert H K. Association between c135 G/A genotypes and RET proto-oncogene germline mutations and phenotype of Hirschsprung's disease.  Lancet. 2002;  359 1200-1205
• 12 Maniè S, Santoro M, Fusco A, Billaud M. The RET receptor: Function in development and dysfunction in congenital malformation.  Trends Genet. 2001;  17 580-589
• 13 McCabe E R. Hirschsprung's disease: dissecting complexity in a pathogenetic network.  Lancet. 2002;  359 1169-1170
• 14 Natarajan D, Marcos-Gutierrez C, Pachnis V, de Graaff E. Requirement of signalling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.  Development. 2002;  129 5151-5160
• 15 Parisi M A, Kapur R P. Genetics of Hirschsprung disease.  Curr Opin Pediatr. 2000;  12 610-617
• 16 Pingault V, Bondurand N, Kuhlbrodt K, Goerich D E, Prehu M O, Puliti A, Herbarth B, Hermans-Borgmeyer I, Legius E, Matthijs G, Amiel J, Lyonnet S, Ceccherini I, Romeo G, Smith J C, Read A P, Wegner M, Goossens M. SOX10 mutations in patients with Waardenburg-Hirschsprung disease.  Nature Genet. 1998;  18 171-173
• 17 Puffenberger E K, Hosoda K, Washington S S, Nakao K, deWit D, Yanagisawa M, Chakravati A. A missense mutation of the endothelin-B receptor gene in multigenic Hirschsprung's disease.  Cell. 1994;  79 1257-1266
• 18 Svensson P J, Molander J L, Eng C, Anvret M, Nordenskjöld A. Low frequency of RET mutations in Hirschsprung disease in Sweden.  Clin Genet. 1998;  54 39-44
• 19 Vockley J, Rinaldo P, Bennett M J, Matern D, Vladutiu G D. Synergistic heterozygosity: disease resulting from multiple partial defects in one or more metabolic pathways.  Mol Genet Metab. 2000;  71 10-18
• 20 Vladutiu G D. Heterozygosity: an expanding role in proteomics.  Mol Genet Metab. 2001;  74 51-63
• 21 Wakamatsu N, Yamada Y, Yamada K, Ono T, Nomura N, Taniguchi H, Kitoh H, Mutoh N, Yamanaka T, Mushiake K, Kato K, Sonta S, Nagaya M. Mutations in SIP1, encoding Smad interacting protein-1, cause a form of Hirschsprung disease.  Nature Genet. 2001;  27 369-370