Eine Population von CK19-positiven, insulinproduzierenden Surrogatzellen hergestellt aus embryonalen Stammzellen der Maus

Fragestellung: Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind in der Lage jeden adulten Zelltyp durch Differenzierung hervorzubringen. Die geringe Verfügbarkeit von Spenderorganen zur Transplantationstherapie des Typ-1-Diabetes mellitus hat daher die Erforschung von Surrogatzellen aus ES-Zellen mit ähnlichen Charakteristika wie endokrine Beta-Zellen in den Fokus gerückt. Das Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines Differenzierungsprotokolls, welches verlässlich insulinproduzierende Zellen aus ES-Zellen erzeugt und die Kombinierung dieses Protokolls mit einem Sortierungsverfahren dieser Zellen.

Methodik: Die Sequenz des eYFP-Gens wurde in einem Plasmid durch Klonierung unter die Kontrolle eines 2,9 kb großen Promoterfragments des Cytokeratin 19 Gens (CK19) gebracht. Maus-ES-Zellen der Linie ES-D3 wurden mit diesem Plasmid stabil transfiziert und mit einem neuen Differenzierungsprotokoll differenziert. Am Tag 12, 19 und 26 der Differenzierung wurden eYFP+ und eYFP- Zellen mit einem Durchflusszytometer aufgereinigt und charakterisiert.

Ergebnisse: Die Analyse der endogenen CK19 Expression erbrachte am Tag 26 eine 7-fache Steigerung der CK19 Expression in YFP+ Zellen verglichen mit YFP- Zellen. Auch CA2 (Carboanhydrase 2) zeigte eine 9fach erhöhte Expression. Die quantitative Analyse der Genexpression von Insulin zeigte eine geringe Expression bis zum Tag 19 des Differenzierungsprotokolls. Am Tag 26 konnte eine um 38fach signifikant erhöhte Expression von Insulin in YFP+ Zellen gegenüber YFP- Zellen gemessen werden. Die Expression von Glucagon war bis zum Tag 19 nicht messbar, stieg aber dann auf einen 12fach erhöhten Wert in YFP- Zellen gegenüber YFP+ Zellen an. Die Ultrastruktur von YFP+ Zellen zeigte eine eindeutige Differenzierung in insulinproduzierende Zellen mit subzellulären Organellen zur Synthese, Prozessierung, Speicherung und Freisetzung von Insulin in Form von sekretorischen Granula. Außerdem waren nur eYFP+ Zellen immunoreaktiv für C-Peptid und Insulin. eYFP- Zellen waren negativ für C-Peptid.

Schlussfolgerungen: Cytokeratin 19 ist ein Marker für pankreatische Duktus-Zellen. In der Annahme, dass ES-Zellen im Verlaufe ihrer Differenzierung mit dem neuen Differenzierungsprotokoll das Stadium der Duktuszelle durchlaufen könnten, haben wir ein Differenzierungs- und Selektionsprotokoll kombiniert, um fluoreszierende, YFP+ Zellen von anderen Zellen abtrennen zu können. Diese Zellen exprimierten stark vermehrt endogenes CK19, CA2 und Insulin. Die nicht-fluoreszierenden eYFP- Zellen wurden ebenfalls aufgereinigt und zeigten keine nennenswerte Insulinexpression, aber eine deutlich erhöhte Glucagonexpression. Die Charakterisierung beider Populationen zeigte, dass nur eYFP+ Zellen das Insulingen exprimierten, Insulin prozessierten und speicherten und freisetzen konnten.