Eine Plasmaextraktion durch Free-Flow-Elektrophorese ermöglicht die selektive Bestimmung von Insulinanaloga in Gegenwart von endogenem Normalinsulin

Fragestellung: Die spezifische Bestimmung der Insulinanaloga Glargine, Detemir, Aspart, Lispro und Glulisine ist eine schwierige analytische Fragestellung, insbesondere, wenn im Plasma der Patienten auch noch endogenes Insulin vorhanden ist. Während für diese Analoga in vielen Fällen Kreuzreaktivitäten mit anderen Tests für Normalinsulin beobachtet wurden, ist lediglich für Insulin lispro aktuell ein spezifischer Radioimmunoassay verfügbar.

Methodik: Wir untersuchten in dieser Pilotstudie die Möglichkeit, dieses Trennproblem durch quantitative prä-analytische Serumseparation mithilfe der Free-Flow-Elektrophorese zu lösen. Hierfür wurde Plasma von gesunden freiwilligen Personen gewonnen und mit allen verschiedenen Insulinanaloga versetzt, so dass diese jeweils in therapeutisch relevanten Konzentrationen (20–100µl) vorlagen. Anschließend wurden die Proben verdünnt und Aliquote direkt einer Plasmaseparation durch Free-Flow-Elektrophorese (FFE) unterzogen. Bei dieser Methode werden die Plasmaproteine entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem laminaren Flüssigkeitsfilm elektrophoretisch aufgetrennt. Da keine Trennmatix vergleichbar der Chromatographie oder Geleelektrophorese vorhanden ist, können die Proteine unter nativen Bedingungen in kurzer Zeit mit hoher Reproduzierbarkeit getrennt werden. Nach Optimierung der Methode für die Trennung der verschiedenen Analoginsuline wurden diese quantitativ gesammelt und mittels eines bekanntermaßen mit allen Analoga kreuzreaktiven Chemilumineszenztests für Normalinsulin gemessen (Invitron, Cardiff, UK). Der Nachweis der Identität der Analoginsuline in ihren jeweiligen Fraktionen erfolgte vorher durch Gelelektrophorese und mittels Massenspektroskopie.

Ergebnisse: Bei diesen Pilotexperimenten zeigte lediglich Lispro eine vergleichbare Trenncharakteristik wie Normalinsulin (identische isoelektrische Punkte) und musste mit dem spezifischen Immunoassay (Millipore, St. Charles, MO) bestimmt werden. Alle anderen Insulinanaloga konnten aus der artifiziell kombinierten Plasmaprobe quantitativ abgetrennt und mit hoher Wiederfindungsrate bestimmt werden.

Schlussfolgerungen: Nach diesen erfolgreichen Versuchen, wird die Methode nun im nächsten Schritt standardisiert und validiert, damit die notwendige Qualität, Präzision und Genauigkeit für den Einsatz der FFE-Technologie auch im Rahmen klinischer Studien erreicht wird.