Interleukin-1β und oxidativer Stress wirken gegensätzlich auf die IRS-1- und IRS-2-Promotoraktivität in HepG2-Zellen

Hintergrund: Die Bedeutung der Insulinrezeptorsubstrat(IRS)-Proteine-1/-2 für den hepatischen Glucosestoffwechsel und die Aktivierung nachgeschalteter Signalwege ist bereits ausführlich in vivo und in vitro untersucht worden. Jedoch ist über die Transkriptionsregulation der verschiedenen IRS-Proteine auf molekularer Ebene nur wenig bekannt. Im vorliegenden Projekt werden daher die Wirkung von oxidativem Stress und dem proinflammatorischen Zytokin Interleukin(IL)-1β auf die Promotoraktivität in HepG2-Zellen untersucht.

Methodik: Nach Klonierung der humanen IRS-1- und IRS-2-Promotoren wurden sukzessiv verkürzte Promotorfragmente transient in HepG2-Zellen transfiziert und mittels eines dualen Luziferase Reporterassays analysiert. Um mögliche die IRS-1/-2-Transkription modulierende Signalwege zu identifizieren, wurden HepG2-Zellen mit den entsprechenden IRS-1/-2-Promotorregionen transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden dann mit H₂O₂, IL-1β und PD98,059 behandelt und bezüglich der Promotoraktivität analysiert.

Ergebnisse: Es konnte im IRS-1 Promotor eine Sequenz identifiziert werden, die 2420 bp vom Translationsstart entfernt lag und die stärkste basale Promotoraktivität in HepG2 Zellen zeigte. Im IRS-2 Promotor hingegen lag die Region stärkster basaler Promotoraktivität 688 bp vom Translationsstart entfernt. Um den Einfluss von Erk auf die basale Promotoraktivität zu untersuchen, wurden entsprechend transfizierte HepG2-Zellen mit PD98,059 inkubiert. Dies führte zu einer Verdoppelung der IRS-1-Promotoraktivität und einer nahezu vollständigen Suppression der IRS-2-Promotoraktivität. Die Behandlung von HepG2-Zellen mit H₂O₂ führte zu einem Abfall der IRS-1-Promotoraktivität um ca. 40%, jedoch zu einem Anstieg der IRS-2-Promotoraktivität um ca. 40%. Präinkubation der IRS-2-Promotor-transfizierten Zellen mit PD98,059 führte zu einer kompletten Inhibition der H₂O₂-induzierten Promotoraktivität. Ein ähnliches Reaktionsmuster konnte durch eine Inkubation mit IL-1β gezeigt werden mit einem Abfall der IRS-1- und einem Anstieg der IRS-2-Promotoraktivität um ca. -50%, bzw. +40%. Auch die IL-1β-stimulierte IRS-2-Promotoraktivität ließ sich durch eine Präinkubation mit PD98,059 komplett supprimieren.

Zusammenfassung: Überraschenderweise beeinflussen IL-1β und oxidativer Stress die IRS-1- und IRS-2-Promotoraktivität gegensätzlich. Der IRS-2-Promotor wird durch oxidativen Stress und IL-1β Erk-abhängig aktiviert, während diese Faktoren zu einer Inaktivierung des IRS-1-Promotors führen. Außerdem ist die basale Aktivität beider Promotoren durch die Inhibition des MAP-Kinasenwegs entgegengesetzt beeinflusst.