Auflösung einer KEL1 Diskrepanz als Fallbeispiel der haplotypspezifischen Nanopore-Sequenzierung von Blutgruppengenen

Zusammenfassung

Aufgrund der starken Immunogenität des KEL1-Antigens ist dessen Erhebung oft Teil der routinemäßigen Spendertypisierung. Am Blutspendezentrum Zürich wird KEL1 serologisch als auch genetisch mittels Hochdurchsatzgenotypisierung bestimmt. Genotyp-Phänotypdiskrepanzen werden normalerweise durch eine aufwendige Sanger-Sequenzierung aller 19 Exons gelöst, welche jedoch keine Erstellung von Haplotypen zulässt. Hier präsentieren wir ein alternatives Vorgehen, das auf der neuesten Sequenzierungstechnologie von Oxford Nanopore Technologies basiert und die Generierung von Haplotypen ganzer Gene ermöglicht.

Zur Ermittlung der KEL1-Expression kamen serologische Standardmethoden zur Anwendung. Vier Varianten innerhalb des KEL-Gens waren Teil der auf MALDI-TOF Massenspektrometrie basierenden Hochdurchsatz genotypisierung, darunter c.578C>T, welches die KEL1/2-Expression bestimmt. Die Bestätigung diskrepanter Ergebnisse erfolgte mittels PCR-SSP und serologischen Untersuchungen zur Antigenexpressionsstärke wie Adsorptions-Elutionsanalysen und Durchflusszytometrie. Zur Auflösung einer Diskrepanz bei einem Spender amplifizierten wir das ~21 kb lange KEL mit zwei sich um 4.4 kb überlappenden «long-range» PCRs von 12.7 kb und 14.3 kb Länge. Die Überlappung war dabei für die Haplotypisierung wesentlich. Die Nanopore-Sequenzierung der PCR-Amplifikate erfolgte auf einer Flongle flow cell, und die detektierten exonischen Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt.

Wir identifizierten einen heterozygoten KEL*01/02-Blutspender mit einem KEL:-1,2 (K-k+) Phänotyp. Diese Diskrepanz wies auf ein Null-Allel (KEL*01N) hin. Die Analyse der Probe ergab eine bisher bei der ISBT noch nicht beschriebene Missense-Variante in Exon 11 (c.1241C>A, p.Thr414Lys, rs1384232704), welche dem KEL*01-Allel zugeordnet werden konnte. Da kein KEL1-Antigen auf der Oberfläche der Erythrozyten nachweisbar war, wurde die Genvariante als Null-Allel definiert.

Mit Hilfe der Nanopore-Sequenzierung konnten wir eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Phänotyp innerhalb kurzer Zeit auflösen und ein neues KEL*01N-Allel beschreiben. Die Long-Read Technologie vereinfachte maßgeblich die Haplotypisierung des KEL-Gens und dies in einem kostengünstigen sowie zeitsparenden Verfahren, welches sich auch für die Abklärung von Genotyp-Phänotypdiskrepanzen in vielen anderen Blutgruppensystemen eignet.

Abstract

Since the KEL1 antigen of the Kell blood group system is very immunogenic, it is usually determined in routine donor typing. At our blood service in Zurich, KEL1 is determined by both serology and high-throughput genotyping. Genotype-phenotype discrepancies are normally resolved by laborious Sanger sequencing of all 19 exons without haplotype phasing capability. Here, we present an alternative protocol relying on sequencing with Oxford Nanopore Technologies (ONT), which enables the generation of full-gene haplotypes.

Expression of KEL1 antigen was measured by standard serological techniques. Four variants within the KEL gene were part of our MALDI-TOF mass spectrometry based high-throughput blood group genotyping routine, including c.578C>T determining KEL1/2 expression. Genotype-phenotype discrepancies were reassessed by commercially available PCR-SSP kits, adsorption-elution as well as flow cytometry experiments. To resolve a discrepancy in one donor, the entire KEL gene (~21 kb) was amplified in two long-range PCRs (fragments of 12.7 and 14.3 kb, respectively), exhibiting a large overlap (~4.4 kb) essential for haplotype phasing. Amplicons were sequenced on a Flongle flow cell (ONT) and detected exonic variants were confirmed with Sanger sequencing.

We identified a heterozygous KEL*01/02 blood donor with a KEL:-1,2 (K-k+) phenotype. This discrepancy pointed to a null allele (KEL*01N) as no KEL1 antigen could be detected on the erythrocyte surface. A few minutes of Nanopore sequencing already yielded enough data for reliable variant calling. A heterozygous variant in the overlap sequence allowed complete gene haplotype phasing. In exon 11, we identified a missense variant c.1241C>A (p.Thr414Lys, rs1384232704), which was phased to the KEL*01 allele. The variant was yet undescribed, despite the over 100 alleles collected by the ISBT, and was confirmed by Sanger sequencing.

Using Nanopore sequencing, we resolved a genotype-phenotype discrepancy within short turnaround time and discovered a novel KEL*01N allele. The long reads allowed phasing of detected variants to the respective KEL*01/02 background and even constructing full-length KEL haplotypes. The use of a protocol and flow cell optimized for single-sample analysis kept time and expenses competitive. Overall, our approach proved very promising for resolving genotype-phenotype discrepancies in many blood group systems.

Schlüsselwörter

Blutgruppenallelbestimmung - Nanopore-Technologie - Haplotyp - Long-Read Sequenzierung

Keywords

Blood group allele determination - nanopore technology - haplotype - long-read sequencing

Publication History

Article published online:
21 August 2024

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