Farbstofffreie Zweiphotonenmikroskopie der Augenhornhaut

Zusammenfassung

Hintergrund: Die dreidimensionale Bildgebung der Kornea unter physiologischen Bedingungen setzt ein Kontrastverfahren voraus, das möglichst ohne extern eingebrachte Farbstoffe Zellen und extrazelluläre Matrix hochauflösend abbildet. Ausgerechnet die wesentliche Eigenschaft der Transparenz der Kornea macht allerdings ihre extrazelluläre Matrix für farbstofffreie Streulichtverfahren unsichtbar. Die nicht lineare Optik hält für die Visualisierung der extrazellulären Matrix neuartige Kontrastverfahren bereit. Methoden: Die auf Femtosekundenlaser gestützte Mikroskopie beruht auf der nicht linearen optischen Wechselwirkung der räumlich und zeitlich hoch konzentrierten Laserstrahlung mit dem Gewebe. Die Vorteile der Methode gegenüber herkömmlichen Laserscanning-Verfahren liegen bei einer intrinsischen Tiefenselektivität, einer reduzierten Phototoxizität und einer hohen Eindringtiefe des vergleichsweise längerwelligen Lichts. Für die Visualisierung der kornealen Substrukturen sind besonders 2 Kontrastverfahren interessant, die Zweiphotonen-angeregte Eigenfluoreszenz des zellulären NADH und NADPH und die Frequenzverdopplung (Second Harmonic Generation, SHG) im Kollagen I des Stromas. Ergebnisse: Am Beispiel von Ex-vivo-Aufnahmen der Hornhaut des Kaninchens wird die Leistungsfähigkeit der nicht linearen Mikroskopie deutlich. Im Epithel lässt sich die Schichtung aus Schuppenzellen, Flügelzellen und Basalzellen über die NAD(P)H-Eigenfluoreszenz ohne Farbstoff dreidimensional aufnehmen, im Stroma werden analog die Keratozyten visualisiert. Die lamellare Schichtung der Kollagenfibrillen im Stroma ist in virtuellen Tiefenschnitten im SHG-Bild zu sehen. In den transkorneal erfassten SHG-Schichtbildern tritt analog zur Architektur der Kollagenlamellen eine charakteristische Streifung auf mit zunehmend großflächiger werdender Ausrichtung und wechselnden Winkeln von 90° und 45° von anterior zu posterior. Diese Streifung fehlt allerdings in der Rückwärtsdetektion. Erste Ergebnisse an photochemisch mit Riboflavin und UVA-Strahlung quervernetzter Hornhaut im Tiermodell zeigen eine Signatur noch 5 Wochen nach Behandlung in Form einer inhomogeneren Verteilung der Keratozyten–Autofluoreszenz. Schlussfolgerungen: Wie an diesem Beispiel und an aktuellen internationalen Forschungsarbeiten zu erkennen ist, entwickelt sich die Femtosekundenlaser-gestützte Mehrphotonenmikroskopie zu einem farbstofffreien Bildgebungsverfahren für die Kornea und ergänzt Verfahren wie die Optische Kohärenztomografie und die konfokale Streulichtmikroskopie.

Abstract

Background: Three-dimensional imaging of the cornea under physiological conditions is best performed with intrinsic contrast mechanisms for the visualisation of cells and extracellular matrix. However, the unique transparency of the cornea goes along with a lack of contrast for the extracellular matrix (ECM) in reflective mode microscopy and optical coherence tomography. Methods: Femtosecond laser-based non-linear microscopy provides novel contrast mechanisms for the visualisation of ECM. The confinement of the non-linear contrast to the focus volume provides an intrinsic sectioning property for 3D imaging. Further advantages of the infrared light are lower phototoxicity and higher penetration depth into the tissue. For the visualisation of the cornea and its layered substructures two non-linear contrast mechanisms are of main interest: Two-photon excited autofluorescence of NAD(P)H in the cytoplasma and second harmonic generation (SHG) in the collagen-I fibres of the stroma. Ex-vivo corneas of the rabbit were imaged to demonstrate the abilities of non-linear microscopy. Results: Using the autofluorescence of NAD(P)H the corneal epithelium with squamous cells, wing cells and basal cells is visualised in three dimensions without additional exogenoeus staining. Stromal keratocytes are also imaged using the NAD(P)H autofluoresecence. The layered structure of lamella in the stroma is visible after virtual resclicing of the 3D volume data. The en-face SHG images detected through the transparent cornea in forward direction show areas of parallel streaks, which increase in size and periodically alter in orientation (90°, 45°) with increasing depth from anterior to posterior. These streaks are not visible in the backward SHG signal. First results on rabbit corneas, which were cross-linked with Rivoflavin and UV application showed a signature of treatment five weeks post treatment. There were zones in the stroma totally lacking NAD(P)H autofluorescence and the abundance of keratocytes was less homogeneous than in control corneas. Conclusion: These results and current reports on applications in the literature show that femtosecond laser-based non-linear microscopy is an emerging imaging modality which provides dye-free imaging of the corneal ECM and therefore complements scattering imaging modalities such as optical coherence tomography and confocal laser scanning microscopy in the reflective mode.

Schlüsselwörter

Kornea - Zweiphotonen-Mikroskopie - nicht lineare Mikroskopie - Quervernetzung - Frequenzverdopplung

Key words

cornea - non-linear microscopy - two-photon microscopy - second harmonic generation

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