Schlüsselwörter Morbus haemolyticus neonatalis - irreguläre Antikörper - Anti-C - Anti-G - Rhesus-Prophylaxe
Key words hemolytic disease of the newborn - irregular antibodies - anti-C - anti-G - rhesus prophylaxis
Einleitung
Irreguläre antierythrozytäre Alloantikörper gegen Merkmale des Rhesussystems können
einen Morbus haemolyticus neonatorum (MHN) auslösen. Da die fetalen Antigene des
Rhesussystems bereits in der Frühphase der Gravidität exprimiert werden, reagiert
eine rhesusnegative Schwangere – nach Einschwemmung kritischer Mengen
Rhesus-positiven fetalen Bluts – auf diesen immunogenen Stimulus mit Bildung
antierythrozytärer Antikörper, die zur Beladung und Elimination fetaler Erythrozyten
führen. Wirksam sind Antikörper der Subklassen IgG1 und IgG3. Ursache eines MHN ist
zumeist eine Alloimmunisierung der Mutter gegen das Rhesusmerkmal D des Fetus.
Selten wird ein MHN durch Alloantikörper der Spezifitäten Anti-C, Anti-c, Anti-E und
Anti-e hervorgerufen. Hierunter sind vor allem Anti-c-Antikörper klinisch relevant,
die zu ähnlich schweren Verlaufsformen wie bei einem Anti-D-MHN führen können [1 ]. Eine Rarität stellt ein durch Anti-G verursachter MHN
dar. Die Besonderheit des G-Epitops liegt darin, dass es nahezu regelhaft auf
Erythrozyten exprimiert wird, welche das C- und/oder D-Antigen tragen [2 ]. Wir berichten hier über die immunhämatologische
Konstellation, die einen schweren MHN auslöste, da der gefundene maternale
anti-D-Antikörper bei einem rhesusnegativen Feten als irrelevant angesehen wurde,
stellen die zielgerichtete Diagnostik vor und diskutieren Maßnahmen zur Prophylaxe
und zur Therapie bei MHN.
Kasuistik
Ein 2 Tage altes männliches Neugeborenes wurde unter dem klinischen Bild eines
Icterus gravis in der Universitätskinderklinik Düsseldorf aufgenommen. Die
34-jährige Mutter (G2, P2) des Kindes ist deutscher Herkunft und trägt die
Blutgruppe A Rhesus negativ (D neg., Rh-Formel ccddee). Bei ihrer vorausgegangenen
Schwangerschaft wurde die übliche 2-zeitige Rhesusprophylaxe durchgeführt. Das 1.
Kind der Patientin ist rhesusnegativ (D neg.) und hat ein isoliertes C-Merkmal
(Rh-Formel Ccddee). Die nach den Mutterschaftsrichtlinien vorgeschriebene
Antikörperdiagnostik wurde bei der erneuten Schwangerschaft zum Zeitpunkt der 8. SSW
in einem externen Labor durchgeführt. Dabei wurde ein irregulärer antierythrozytärer
Alloantikörper der Spezifität Anti-D (Titer 1 : 128) im indirekten Coombs-Test
(Gelkarte) gefunden. Der verantwortliche Gynäkologe veranlasste eine
Pränataldiagnostik mit molekulargenetischer Untersuchung auf das fetale
Rhesusmerkmal D aus mütterlichem Plasma. Dabei wurden, in Übereinstimmung mit dem
postnatalen serologischen Ergebnis „Rhesus negativ (D neg.)“, keine D-spezifischen
Nukleinsäurepolymorphismen nachgewiesen. Wie im Mutterpass festgehalten, wurde in
Anbetracht des molekulargenetischen Untersuchungsergebnisses „Nachweis eines
Rhesus-negativen (D neg.) Fetus“ in der 2. Schwangerschaft auf eine
Anti-D-Prophylaxe bei der Mutter verzichtet. Weiterhin findet sich dokumentiert,
dass Verlaufskontrollen keinen Anhalt für eine Hämolyse beim Fetus erbrachten. In
der 21. SSW wurde eine Doppler-Sonografie der fetalen A. cerebri media unter der
Frage einer Flussbeschleunigung als Hinweis auf eine klinisch relevante Hämolyse
durchgeführt. Die im Mutterpass dokumentierten Antikörpertiter (ohne Angabe von
Spezifitäten) beliefen sich auf 1 : 128 (8. SSW), 1 : 128 (12. SSW), 1 : 512
(15. SSW) und 1: 512 (19. SSW). In der 39. SSW + 5 wurde die Zweitgravida vaginal
von einem Jungen in einem Geburtshaus entbunden (Geburtsgewicht 3980 g, APGAR-Index
9/10/10). Am 2. Tag postnatal wurde das Neugeborene „bei zunehmender Gelbfärbung“
einem niedergelassenen Kinderarzt vorgestellt, der es umgehend in die nächstgelegene
Kinderklinik einwies. Von hier wurde das Kind bei einer Hyperbilirubinämie von
32,3 mg/dl notfallmäßig auf die Intensivstation des Zentrums für Kinder- und
Jugendmedizin des Universitätsklinikums Düsseldorf verlegt. Befund bei Übernahme:
eutropher Neugeborener in reduziertem Allgemeinzustand, ausgeprägt ikterisches
Hautkolorit, sonst klinisch unauffälliger körperlicher Untersuchungsbefund.
Laborergebnisse bei Aufnahme: Ges.-Bilirubin 30,55 (Norm < 7,0) mg/dl, direktes
Bilirubin 3,14 (< 0,30) mg/dl, indirektes Bilirubin 27,41 mg/dl, C-reaktives
Protein 4,2 (> 0,5) mg/dl, Laktatdehydrogenase 1508 (< 953) U/l, Leukozyten
23,5 (5,0–21,0) × 1000/µl, Erythrozyten 3,51 (4,00–6,30) Mio./µl, Hämoglobin 13,7
(13,0–22,0) g/dl, Hämatokrit 40,8 (42,0–67,0) %, MCV 116,2 (89,0–117,0) fl, MCH 39,0
(31,0–41,0) pg, MCHC 33,6 (31,0–38,0) g Hb/dl, Thrombozyten 297 (160–320) × 1000/µl.
Auf Grund des stark erhöhten Gesamt-Bilirubins wurde sofort eine intensive
Phototherapie über 6 h eingeleitet. Allerdings konnte hierunter kein Rückgang der
Hyperbilirubinämie erzielt werden, so dass eine Austauschtransfusion mit dem
3-fachen kindlichen Blutvolumen durchgeführt wurde. Die Konzentration des
Gesamt-Bilirubins fiel auf 18,0 mg/dl. Die fortgeführte Fototherapie konnte 24 h
später bei Abfall des Gesamt-Bilirubins auf 12,2 mg/dl beendet werden. Ursache des
bereits bei Aufnahme erhöhten und im Verlauf bis auf 4,8 mg/dl ansteigenden
C-reaktiven Proteins war eine Sepsis (Nachweis Streptococcus agalactiae und
Staphylococcus aureus in der Blutkultur), die nach Antibiogramm gezielt mit
Ampicillin und Oxacillin behandelt wurde. Nach 2-wöchigem Klinikaufenthalt konnte
das Kind in gutem Allgemeinzustand entlassen werden.
Material und Methodik
Blutgruppenbestimmungen im AB0- und Rhesussystem und immunhämatologische Diagnostik
(Antikörpersuchtest, Antikörperdifferenzierung, Antikörpertiterbestimmungen im
indirekten Coombs-Test [indirekten Antiglobulintest, IAT]) und Durchführung des
monospezifischen direkten Coombs-Tests (IgG und C3d) erfolgten mittels
Gelkartentechnik (ID-Cards, ID-DiaCell, ID-DiaScreen, ID-DiaPanel, Bio-Rad,
München). Zur Säureelution gebundener antierythrozytärer Antikörper aus EDTA-Blut
des Neugeborenen setzten wir gebrauchsfertige Reagenzien ein (DiaCidel, Bio-Rad,
München, vormals DiaMed, Köln). Die molekulargenetische Bestimmung des fetalen
RHD -Merkmals aus mütterlichem Plasma wurde mittels Realtime PCR (ABI
7300, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) vorgenommen. Dazu wurde eine
Duplex-PCR für Exon 5/Exon 7 zur Detektion von fetalem RHD eingesetzt. Die
Differenzialabsorptions- und Elutionsuntersuchungen führten wir mit mütterlichem
Plasma und ccD.EE- bzw. Ccddee-Testerythrozyten (Bio-Rad) durch. Hierzu erfolgte
eine Bestätigungsdiagnostik im Immunhämatologischen Labor des DRK-Blutspendedienstes
NSTOB, Institut Dessau. Zur Identifizierung des Anti-G-Antikörpers setzten wir die
Methode nach Issitt und Anstee ein [3 ]. Hierzu wurden die
im Patientenplasma vorhandenen Antikörper zunächst mit D-positiven und C-negativen
Testerythrozyten absorbiert. Im nächsten Schritt erfolgte eine weitere Absorption
des Eluats auf C-positive, D-negative Erythrozyten ([Tab. 1 ]). Der Untersuchungsablauf ist in [Abb. 1 ] und [2 ] schematisch
zusammengefasst.
Abb. 1 Schritt 1: 1. Absorption des Patientenplasmas an
ccD.ee-Testerythrozyten. Anti-G wird an den Erythrozyten absorbiert, Anti-C
bleibt frei im Absorbat.
Abb. 2 Schritt 2: 2. Absorption. Hierbei wird Anti-G im Eluat aus der
1. Absorption an Ccddee-Testerythrozyten absorbiert. Es bleibt kein Antikörper
frei im Absorbat.
Tab. 1 Prinzip der Absorptions-Elutionsuntersuchung zum
Nachweis von Anti-G, nach Issitt und Anstee [3 ].
Antikörper im Patientenserum
Anti-D
Anti-D
Testerythrozyten für 1. Absorption
C - D + G +
C - D + G +
Antikörper im 1. Eluat
Anti-D
Anti-D
Testerythrozyten für 2. Absorption
C + D - G +
C + D - G +
Antikörper im 2. Eluat
Anti-G
kein Antikörper
Ergebnisse und Diskussion
Ergebnisse und Diskussion
Beim Neugeborenen wurden die erythrozytären Blutgruppenmerkmale mit A Rhesus negativ
(D neg.), Rhesusformel Ccddee, Kell (K) negativ bestimmt. Der polyspezifische
direkte Coombs-Test war 4-fach positiv; der monospezifische direkte Coombs-Test
zeigte eine starke IgG-Beladung (4+) der kindlichen Erythrozyten an. In der
Elutionsuntersuchung der kindlichen Erythrozyten waren irreguläre Antikörper der
vermeintlichen Spezifitäten Anti-C und Anti-D (IAT) nachweisbar. Im
Antikörpersuchtest (IAT) mit kindlichem Plasma reagierten die Suchzellen I und II
positiv. Im mütterlichen Plasma waren ebenfalls Antikörper der vermeintlichen
Spezifitäten Anti-C und Anti-D (IAT) nachweisbar. Die jeweils im indirekten
Coombs-Test mittels Gelkartentechnik bestimmten Anti-C- und Anti-D-Antikörper wiesen
im mütterlichen Plasma eine Titerhöhe von 512 bzw. 256 auf.
Während die Immunisierung der Mutter gegen das Merkmal C plausibel war ([Abb. 3 ]), erschien die Ätiologie einer Alloimmunisierung
gegen das D-Antigen zunächst unklar: (1) Die Patientin hatte eine komplett negative
Transfusionsanamnese, insbesondere keine zellulären Blutprodukte erhalten. (2) Eine
denkbare Alloimmunisierung der Patientin gegen das Merkmal D während ihrer
Erstschwangerschaft schied aufgrund der Rhesusformel des 1. Kindes (Ccddee) aus. Wir
führten deshalb zusätzliche Differenzialabsorptions- und Elutionsuntersuchungen aus
mütterlichem Plasma mit ccD.EE- und Ccddee-Testerythrozyten durch ([Abb. 4 ] und [5 ]). Aus der
Tatsache, dass nach Absorption und Elution mit ccD.EE-Testerythrozyten ein
Antikörper der Spezifität Anti-C und mit Ccddee-Erythrozyten ein Antikörper der
Spezifität Anti-D detektierbar waren, ließ sich auf das Vorliegen eines Antikörpers
der Spezifität Anti-G schließen. Die Diagnostik im Immunhämatologischen Labor des
DRK-Blutspendediensts NSTOB, Institut Dessau, bestätigte die Antikörper Anti-C und
Anti-G. Es fanden sich ein Anti-C- + Anti-G-Titer von 256 und ein Anti-G-Titer von
32. Gleichfalls bestätigt wurde, dass kein Anti-D-Antikörper vorlag.
Abb. 3 Immunisierungskonstellation bei der 1. Schwangerschaft der
Patientin. Kind 1 hat die Rhesusformel Ccddee und ist G-positiv [6 ], [7 ]. Die Mutter
(Rhesusformel ccddee) wird gegen die Rhesusantigene C und G immunisiert.
Abb. 4 Antikörperdifferenzierung nach Absorption und Elution mit
ccD.EE-Testerythrozyten (indirekter Coombs-Test; Differenzierungspanel,
Bio-Rad). Die Testzellen 1–3 und 8 sind D- und G-positiv, die Testzelle 4 ist C-
und G-positiv, D-negativ. Nachweis einer Antikörperreagibilität gegen C- und
D-positive Testzellen.
Abb. 5 Antikörperdifferenzierung nach Absorption und Elution mit
Ccddee-Testerythrozyten (indirekter Coombs-Test, Differenzierungspanel,
Bio-Rad). Die Testzellen 1–3 und 8 sind D- und G-positiv, die Testzelle 4 ist C-
und G-positiv, D-negativ. Aus dem Reaktionsmuster lässt sich auf die
Antikörperspezifität Anti-G schließen.
Das Rhesusantigen G (ISBT-Symbol: RH12 ; ISBT-Nummer: 004012) [4 ] wurde erstmalig 1958 von Allen und Tippett beschrieben
[5 ]. Wegweisend war der Befund, dass Anti-CD-Antiseren
eine Agglutination von Erythrozyten eines C-negativen und D-negativen Blutspenders
auslösten [5 ]. Molekulare Basis des G-Epitops ist ein
Thymin am Basenpaar 307 in Exon 2 des RHD- oder RHCE*C- Gens. Hieraus
resultiert die Expression eines Serinrests an Position 103 des Rh-Proteins C oder D
[6 ]. Dies bedeutet, dass Träger eines der folgenden
Allele auch das G-Merkmal besitzen: RHD, RHCE*C*e oder RHCE*C*E
[4 ], [6 ], [7 ]. Für das Rhesusantigen G sind folgende Häufigkeiten beschrieben:
Kaukasier 84 %, Individuen afrikanischen Ursprungs 92 %, Asiaten 100 % [4 ]. Die klinische Relevanz als Ursache eines MHN dürfte
variabel sein. So wurden bei Vorliegen eines Antikörpers der Spezifität Anti-G
unauffällige bis schwere Verlaufsformen eines Morbus haemolyticus neonatorum
berichtet [8 ], [9 ].
Im vorliegenden Fall ergab sich bereits durch das Ausmaß der Hyperbilirubinämie die
unmittelbar bestehende Indikation zur Therapie des Neugeborenen. Als Orientierung
für die Behandlungsbedürftigkeit von Hyperbilirubinämien reifer Neugeborener dient
ein Nomogramm ([Abb. 6 ]), das auch Gegenstand der
AWMF-Leitlinie „Hyperbilirubinämie des Neugeborenen – Diagnostik und Therapie“ ist
[10 ], [11 ]. In den ersten
Tagen nach Geburt ist ein stetiger Anstieg unkonjugierten Bilirubins noch als
physiologisch zu betrachten und zumeist ohne klinische Relevanz, solange der
Serumspiegel die 95. bzw. 98. Perzentile mit Spitzenwerten der
Bilirubinkonzentration von 18 bzw. 20 mg/dl nicht übersteigt [11 ]. Die beschriebene immunhämatologische Konstellation erklärt die
Antikörper-induzierte Hämolyse des Kindes, das Ausmaß der resultierenden
Hyperbilirubinämie von > 30 mg/dl 48 h nach Geburt und das unzureichende
Ansprechen auf die intensive Phototherapie innerhalb von 6 h.
Abb. 6 Nomogramm mit altersbezogenen Konzentrationen des Gesamt-Bilirubins
bei reifen Neugeborenen zur Risikoabschätzung einer behandlungsbedürftigen
Hyperbilirubinämie, nach Bhutani et al. [10 ],
modifiziert.
Fazit
Der Nachweis eines irregulären Antikörpers der Spezifität Anti-C plus Anti-D macht
bei Frauen im gebärfähigen Alter, insbesondere im Falle eingetretener
Schwangerschaft, eine gezielte Spezialdiagnostik erforderlich. Bei scheinbar
eindeutig gefundener kombinierter Spezifität gegen das RhD- und RhC-Antigen können –
außer Anti-C + Anti-D – weitere Antikörperkonstellationen vorliegen: (1) Anti-C +
Anti-D + Anti-G, (2) Anti-C + Anti-G, (3) Anti-D + Anti-G oder (4) Anti-G. Die
exakte Differenzierung der Antikörperspezifitäten ist für die adäquate
Rhesusprophylaxe relevant, allzumal bei fehlendem Nachweis bzw. Ausschluss des
Alloantikörpers Anti-D. Je nach Befundkonstellation können sich wichtige Hinweise
auf die klinische Bedeutung bzw. die zu erwartende Schwere eines Morbus haemolyticus
neonatorum ergeben. So ist bei isoliertem Anti-G-Antikörper eher mit einem milden
Verlauf zu rechnen, wie aus berichteten Einzelfällen ersichtlich wird [8 ], [9 ]. Eine sorgfältige
Erhebung der Transfusionsanamnese und Vorgeschichte vorausgegangener
Schwangerschaften in Zusammenschau mit den Blutgruppenbefunden der Geschwisterkinder
trägt zur zielgerichteten Diagnosefindung und korrekten Interpretation auch seltener
Antikörperkonstellationen bei. In dem hier von uns berichteten Fall eines schweren
Morbus haemolyticus neonatalis waren im Mutterpass nur Titerhöhen, aber keine
Antikörperspezifitäten angegeben. Gerade die Untersuchung auf
Antikörperspezifität(en) und deren Dokumentation sind zwingend geboten.
Bei retrospektiver Betrachtung der hier berichteten Kasuistik wird evident, dass der
initial nachgewiesene Alloantikörper der scheinbaren Spezifität Anti-D in der
auswärtigen Diagnostik zusammen mit dem molekulargenetischen Ergebnis eines
RHD -negativen Fetus zur Fehleinschätzung eines „klinisch nicht relevanten
Antikörperbefundes“ führte. Es kann davon ausgegangen werden, dass bei umfassender
Antikörperdifferenzierung im weiteren Verlauf der Schwangerschaft rechtzeitig die
Spezifität „Anti-C plus Anti-D“ zu detektieren gewesen wäre. In Kenntnis dieses
Befundes wäre bei zusätzlicher Bestimmung des fetalen RHCE*C -Merkmals aus
mütterlichem Plasma die Gefahr eines Morbus haemolyticus fetalis bzw. neonatalis
eher einzuschätzen gewesen mit der Konsequenz, die Entbindung in einer Klinik mit
angeschlossenem Level-1-Perinatalzentrum zu veranlassen. Diese Vorkehrung zur
bestmöglichen Versorgung eines Neugeborenen ist nach der aktuellen Leitlinie der
zuständigen Fachgesellschaften bei Morbus haemolyticus fetalis bzw. neonatalis heute
unerlässlich [12 ].
Danksagung
Die Autoren danken Dr. Hartmut Kroll, DRK-Blutspendedienst NSTOB, Institut Dessau,
für die serologische Bestätigungsdiagnostik.
