Erythrozytentransfusion: prätransfusionelle Diagnostik – Teil 2

Antikörpersuchtest

Um die Alloimmunisierung zu erkennen, wird vor der Transfusion der Antikörpersuchtest durchgeführt. Bei diesem Test wird die Reaktivität des Patientenserums oder -plasmas gegen Testerythrozytensuspensionen überprüft, deren Antigenmuster sich so ergänzen, dass, wenn ein irregulärer Antikörper vorliegt, mindestens eine der Suspension positiv reagiert. Laut Richtlinien [1] muss vor allen invasiven und operativen Eingriffen, bei denen intra- und perioperativ eine Transfusion ernsthaft in Betracht kommt, ein Ergebnis des Antikörpersuchtests des zuständigen Laboratoriums vorliegen.

Zweck des Antikörpersuchtests

Zweck des Antikörpersuchtests ist, klinisch relevante Antikörper zu erkennen, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit zu Unverträglichkeitserscheinungen bei den Transfusionen führen. Dies soll sicherstellen, dass entsprechend kompatible Präparate rechtzeitig beschafft werden können.

Mit dem Antikörpersuchtest sollen klinisch relevante Antikörper erkannt werden.

Ziel des Antikörpersuchtests ist dagegen nicht, klinisch nicht relevante Antikörper (z. B. rein kältewirksames Anti-Le(b)) zu erkennen und – zumindest, wenn wie in Deutschland eine serologische Verträglichkeitsprobe in Coombs-Technik vorgenommen wird – das Finden von Antikörpern gegen Antigene, die so selten sind, dass die Transfusion eines antigenpositiven Präparats nicht zu erwarten ist, z. B. Anti-Wr(a).

Die klinische Relevanz unterschiedlicher Antikörper ([Tab. 1]) ergibt sich letztlich aus der Beobachtung von Unverträglichkeitserscheinungen; sie hängt wesentlich von der Spezifität und dem Reaktionsverhalten des Antikörpers ab. Die aktuelle Reaktionsstärke ist von sekundärer Bedeutung, da schwache irreguläre Antikörper durch Gabe antigenpositiver Erythrozyten geboostert werden und so zumindest zu verzögerten Hämolysen führen können.

Tab. 1 Klinische Relevanz von irregulären Antikörpern mittlerer und hoher Frequenz (nach [2], [3]). Die Angaben beziehen sich auf das Blutgruppensystem, gegebenenfalls unter der Angabe von Ausnahmen.

klare Evidenz für Hämolyse oder Morbus haemolyticus neonatorum bzw. Analogieschluss
	AB0 (außer Anti-A1)
	Rh
	Kell
	MNS (außer Anti-M, Anti-N)
	Duffy
	Kidd
	Dombrock
	P
	Anti-PP1Pk
	Vel
	Indian
	Diego
	Colton
	Kx
akute und verzögerte Hämolyse nur bei Antikörpern mit Aktivität bei 37 °C
	MNS: Anti-M, Anti-N
	P1
	LKE
	I
	Le
	AB0: Anti-A1
Einzelberichte hämolytischer Reaktionen
	Lu (milde verzögerte Hämolysen)
	Yt
	Cromer
	Lan
	At(a)
	Jr(a)
	JMH
keine Daten, aber Reaktion wahrscheinlich
	OK
	GIL
	PEL
	MAM
eher keine Reaktion zu erwarten (verträglichste Präparate nehmen)
	Scianna
	LW
	Chido/Rodgers
	Knops
	Er
	Cost

Notwendiges Antigenspektrum im Antikörpersuchtest

Das Antigenspektrum, das auf den Testerythrozytensuspensionen vertreten sein muss, ist in den Regularien der Länder festgeschrieben. International besteht Übereinstimmung, dass folgende Antigene vorhanden sein müssen: C, c, D, E, e, K, k, Fy(a), Fy(b), Jk(a), Jk(b), S, s, M, N, P1, Le(a), Le(b). Darüber hinaus gibt es in einigen Ländern Spezialanforderungen: So wird in Deutschland [1] und der Schweiz [4] Cw gefordert, in der Schweiz [4] darüber hinaus Kp(a) und möglichst auch Lu(a); Frankreich fordert die Anwesenheit der hoch frequenten Antigene Kp(b) und Lu(b). In der Schweiz ist auch spezifiziert, dass Wr(a), Vw und Mg nicht auf den Suchzellen vertreten sein sollte.

Irreguläre Antikörper, besonders Antikörper des Kidd-Systems und Anti-M, können einen deutlichen Dosiseffekt zeigen und lassen sich unter Umständen nur mit Zellen, die das entsprechende Antigen in hoher Dichte tragen (homozygote Erbanlage), nachweisen. Da die Zellen für den Antikörpersuchtest entsprechend ihres Antigenmusters speziell herausgesucht werden, ist es möglich, das Panel so zusammenzustellen, dass wichtige Antigene homozygot vorliegen. Im Regelfall wird das für die Rhesusantigene c, C, e, E, Fy(a), Fy(b), Jk(a), Jk(b), S und s gefordert. Auch hier gibt es wieder international leichte Variationen: Das aufgeführte Spektrum entspricht dem in der Schweiz und Großbritannien. In Deutschland ist es nur eine Empfehlung, und bei den Rhesusantigenen genügt c und D. In Frankreich sind alle Rhesusantigene, Fy(a), Jk(a), Jk(b) und S gefordert, Homozygotie für Fy(b) und s ist nur eine Empfehlung. Die Niederlande verlangen das gesamte Spektrum, darüber hinaus k und M in homozygoter Ausprägung.

Das Vorliegen von „homozygoten“ Zellen im Antikörpersuchtest erleichtert das Finden der Antikörper. In Deutschland ist Homozygotie für c, D, Fy(a), Fy(b), Jk(a), Jk(b), S und s gefordert.

Die Anzahl der Zellen im Antikörpersuchtest ist für dessen Qualität letztlich sekundär, entscheidend, um irreguläre Antikörper nachzuweisen zu können, ist das Antigenmuster und die homozygote Repräsentation (oder eben ihr Fehlen) der Antigene. In den meisten Ländern (Deutschland, Österreich, Großbritannien) sind mindestens 2 Testerythrozytensuspensionen gefordert, in Frankreich 3. Eine Erfüllung der Anforderungen an die Homozygotie ist allerdings mit einem 2-Proben-Suchtest schwierig, sodass im Regelfall 3 Zellen eingesetzt werden müssen, um keine qualitativen Abstriche hinzunehmen.

Das Erfüllen aller Anforderungen zur Homozygotie ist mit einem Suchtest aus nur 2 Zellen kaum möglich.

Geeignete Techniken für den Antikörpersuchtest

Der Antikörpersuchtest soll gemäß den deutschen Richtlinien [1] im indirekten Antihumanglobulintest oder einer Methode mit vergleichbarer Sensitivität und Spezifität erfolgen.

Im Regelfall wird erwartet, dass der Antikörpersuchtest eine Empfindlichkeit besitzt, die mindestens einem Antikörpersuchtest in Röhrchentechnik mit Albumin als Supplement entspricht. Lediglich in Frankreich wird eine Durchführung in Säulen- oder Festphasentechnik gefordert. In Frankreich wird eine Sensitivität von 20 ng/ml Anti-D, in der Schweiz von 10 ng/ml (0,05 IU/ml) gefordert.

Die derzeit für den Antikörpersuchtest verfügbaren Techniken lassen sich grob in Röhrchentechnik, Säulenagglutination und Festphasentechniken einteilen.

Bei der Röhrchentechnik werden Testerythrozyten mit Serum und Supplement (Albumin, LISS [Lösung mit geringer Ionenstärke] oder PEG [Polyethylenglykol]) inkubiert, anschließend gewaschen, mit Antihumanglobulin versetzt, zentrifugiert und beim Aufschütteln die Agglutination beurteilt. Negative Ergebnisse werden durch Zugabe von antikörperbeschichteten Erythrozyten kontrolliert.

Bei der Säulenagglutination werden Testerythrozyten und Serum/Plasma inkubiert und anschließend durch ein mit Gel oder Glaskügelchen gefüllte Säulchen zentrifugiert, das Gel enthält Antihumanglobulin. Positive Reaktionen werden daran erkannt, dass die Erythrozyten oberhalb oder im Gel stecken bleiben.

Die im Patientenbereich am weitesten verbreitete Festphasentechnik ist der Capture-Test, bei dem Mikrotiterplatten mit Erythrozytenmembranen beschichtet sind. Andere Festphasentechniken arbeiten mit magnetisierten Erythrozyten (E. M.-Technologie) oder beschichteten Mikrotiterplatten (Solidscreen).

Säulen- und Festphasentechniken haben gegenüber der Röhrchentechnik den Vorteil, dass das Untersuchungsergebnis für einige Zeit stabil ist und durch einen 2. Beurteiler gegengelesen werden kann. Bei der Röhrchentechnik ist das Zerschütteln schwacher Agglutinate die wichtigste Fehlerursache [5]; sind Agglutinate erst einmal zerschüttelt, können sie auch nach erneuter Zentrifugation nicht mehr sicher reproduziert werden. Die Röhrchentechnik ist deshalb wesentlich abhängiger vom Geschick des Untersuchers als die anderen Techniken, für Laboratorien mit geringen Aufkommen an immunhämatologischen Untersuchungen kann sie nicht empfohlen werden.

Die Röhrchentechnik ist stark abhängig von der Erfahrung des Untersuchers und für Laboratorien mit geringem Aufkommen immunhämatologischer Untersuchungen wenig geeignet.

Es gibt zahlreiche Studien zum Vergleich der unterschiedlichen Techniken, die Studienergebnisse sind jedoch teils diskrepant. Grob gesagt schneidet die Röhrchentechnik in Großbritannien gleichwertig mit der Säulenagglutination ab [5], in Deutschland sind Säulenagglutination und Festphasentechniken deutlich überlegen [6]. Ursache ist vermutlich das intensive Training der Röhrchentechnik in Großbritannien. Zwischen den unterschiedlichen standardisierten Techniken ergeben sich keine relevanten Unterschiede [6], [7].

Der eigentliche klinische Zielparameter bei Studien zu Antikörpersuchtests wäre das Auftreten von Transfusionsreaktionen, hierzu gibt es eine Beobachtungsstudie, in der es begleitend zur Umstellung von PEG-Röhrchen auf Gel zu einer Reduktion verzögerter hämolytischer Reaktionen von 8,3/10 000 auf 1,4/10 000 und verzögerter serologischer Reaktionen von 15,4/100 00 auf 3,2/10 000 kam [8].

In einer Studie war die Umstellung von Röhrchentechnik auf Gel assoziiert mit einer Abnahme der Rate der Transfusionsreaktionen.

Geeignetes Untersuchungsmaterial

Bei Verwendung der Röhrchentechnik mit Albumin oder LISS als Adjuvans ist der Nachweis einiger Antikörper, z. B. Anti-Jk(a) stark abhängig von der Komplementaktivität, als Untersuchungsmaterial sollte daher ausschließlich Serum verwendet werden. Röhrchentechnik mit PEG als Adjuvans und Säulentechniken sind dagegen kaum, Capture- und E. M.-Technik überhaupt nicht abhängig vom Komplement, hier kann Plasma oder Serum benutzt werden [9]. Automatisierungslösungen erfordern im Regelfall EDTA-antikoaguliertes (EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure) Blut.

Der Antikörpersuchtest kann aus Plasma oder Serum durchgeführt werden. Nur bei Verwendung von Röhrchentechnik mit Albumin oder LISS sollte ausschließlich Serum eingesetzt werden.

Rolle der Enzymtechnik

Die Behandlung der Erythrozyten mit Enzym kann die Sensitivität steigern. Es gibt dabei nicht eine Enzymtechnik, sondern eine ganze Reihe in ihrer Auslegung deutlich unterschiedliche Techniken:

• Als Enzyme kommen Papain, Bromelin und Ficin zum Einsatz.

• Die Testzellen können vorbehandelt sein (üblich bei Papain und Ficin), oder das Enzym wird als „Ein-Stufen-Test“ mit dem Plasma zugefügt.

• Die Ablesung kann im Coombs-Test oder in neutraler Karte/Kochsalz erfolgen.

In eigener Erfahrung ist der Papain-Coombs-Ansatz für Rhesus- und Kidd-Antikörper merklich sensitiver als der Standard-Coombs-Ansatz. Die Enzymbehandlung zerstört allerdings einige klinisch relevante Zielantigene, sodass ein alleiniger Ansatz in Enzymtechnik für den Antikörpersuchtest nicht ausreichend ist. Die Enzymtechnik kann daher immer nur ergänzende Technik sein.

In größeren Studien an nicht ausgewählten Kollektiven zeigt sich, dass die zusätzliche Sensitivität des Enzymansatzes mit einem hohen Aufwand für die Abklärung nicht relevanter Befunde erkauft wird. So fand Issitt [10] unter 10 000 Patienten 35, bei denen ein Antikörper nur in Enzymtechnik nachgewiesen wurde. Antigenpositive Präparate erhielten 19 Patienten, bei 1 wurde eine verzögerte Transfusionsreaktion festgestellt, bei 2 anderen wurde der Antikörper geboostert. Dagegen wurden 321 nicht weiterführende Befunde (z. B. unspezifische Reaktivität mit enzymbehandelten Zellen) festgestellt. Dieser geringen Ausbeute stehen einzelne Berichte von akuten Transfusionsreaktionen durch Antikörper, die nur in Enzymtechnik gesehen wurden, gegenüber [11].

Vermutlich aufgrund des erheblichen Abklärungsaufwands für unspezifische Befunde besteht international Konsensus, dass die Enzymtechnik nicht für den Antikörpersuchtest gefordert wird. Es obliegt dem Laborleiter, zu entscheiden, ob der zusätzliche Einsatz der Enzymtechnik in seiner Patientenpopulation sinnvoll ist.

Die Enzymtechnik kann nur ergänzend eingesetzt werden und wird nicht generell gefordert.

Bedeutung von IgM-Antikörpern

Die Bedeutung von reinen IgM-Antikörpern wird immer wieder diskutiert, da Capture- und E. M.-Technik nur IgG-Antikörper nachweisen und IgM-Antikörper zumindest theoretisch gut Komplement aktivieren und eine intravasale Hämolyse auslösen könnten. Derartige Konstellationen sind jedoch extrem selten, da die meisten IgM- von IgG-Antikörpern begleitet werden und die genannten Techniken sehr sensitiv für IgG-Antikörper sind. Eine rationale Beurteilung muss die Vor- und Nachteile der unterschiedlichen Techniken gegeneinander abwägen und darf nicht nur einen isolierten Aspekt betrachten. Aktuell gelten Capture- und E. M.-Technik als gleichwertig zur Säulenagglutination.

Zeitpunkt des Antikörpersuchtests

Nach Transfusionen kommt es zu einer Boosterung eines irregulären Antikörpers, die zu einem raschen Titeranstieg führen kann. Ist der Abstand zwischen Antikörpersuchtest und Transfusion zu groß, besteht das Risiko, dass zwischenzeitlich Antikörper im Rahmen einer sekundären Immunreaktion neu gebildet wurden. In fast allen Regularien wird ein derartiges Boosterungsrisiko in Betracht gezogen, wenn nicht ausgeschlossen werden kann, dass der Patient in den letzten 3 Monaten schwanger war oder transfundiert wurde. Die Angaben zum in diesem Fall vertretbaren Gültigkeitszeitraum des Antikörpersuchtests variieren von 72 Stunden ab Antikörpersuchtest (Niederlande [9]) bis 96 Stunden (Schweiz [4]) ab Blutentnahme. In Deutschland [1] beträgt die Gültigkeit 3 Tage, wobei der Tag der Blutentnahme als Tag 0 zählt; dies entspricht letztlich bis zu 96 Stunden.

In Deutschland ist der Antikörpersuchtest 3 Tage lang gültig, wobei der Tag der Probenentnahme als Tag 0 zählt.

Falls Schwangerschaften und Transfusionen in den letzten 3 Monaten ausgeschlossen werden können, ist der Gültigkeitszeitraum im Allgemeinen länger, in Deutschland sind 7 Tage zulässig [1], in der Schweiz 21 Tage [4], in den Niederlanden sogar „bis zur nächsten Transfusion“ [9]. Ein Problem bei diesem Vorgehen ist das Sicherstellen der nicht stattgehabten Transfusion bzw. Schwangerschaft, hier ist beispielsweise in der Schweiz vorgeschrieben, dass eine vom Arzt unterschriebene Bestätigung im Labor vorliegt.

Falls Schwangerschaften oder Transfusionen in den letzten 3 Monaten ausgeschlossen werden können, kann die Gültigkeit des Antikörpersuchtests in Deutschland auf 7 Tage verlängert werden.

Die begrenzte Gültigkeit des Antikörpersuchtests sollte keinesfalls dazu führen, diesen möglichst spät erst unmittelbar vor der Transfusion durchzuführen. Das Ziel des Antikörpersuchtests ist gerade, Probleme im Vorfeld zu erkennen, um genug Zeit zur Verfügung zu haben, sie abzuklären und gegebenenfalls kompatible Präparate zu organisieren.

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