Palavras-chave
colágeno - joelho - lesão condral - ratos - tratamento
Introdução
Ainda hoje o tratamento das lesões condrais permanece um desafio para médicos ortopedistas, por conta das características de baixo potencial regenerativo inerentes do tecido cartilaginoso.[1]
[2]
Tais lesões são causadas por uma gama de fatores metabólicos, genéticos, vasculares e/ou traumáticos. São classificadas conforme o tamanho e espessura da cartilagem acometida.[3]
[4] Sua incidência real ainda permanece desconhecida, em função de grande parte delas ser assintomáticas e, por conta disso, a maior parte dos pacientes não busca acompanhamento médico, mesmo nos estágios mais avançados da doença. Trata-se da forma comum de doença articular, sobretudo em indivíduos idosos e obesos, manifestando-se por dor, rigidez e limitação da função. As articulações mais comprometidas são aquelas sujeitas a sobrecarga mecânica, em especial a do joelho.[3]
Estima-se que mais de 10% da população acima de 60 anos de idade tenha sérios problemas articulares relacionados a pelo menos algum grau de comprometimento articular.[4] Senna et al.[5] e Henrotin et al.[6] relataram em uma prevalência de 4,14% na população brasileira, e estudos radiológicos mostram alterações em 30% dos homens e mulheres acima de 65 anos, dos quais um terço é sintomático.
Em que pese o papel das lesões de caráter mecânico na degradação da cartilagem articular, o processo inflamatório tem grande importância nas bases fisiopatológicas da doença, desencadeando-a ou acelerando sua evolução.[4] A sequência exata de eventos patológicos permanece pouco compreendida, dificultando o consenso quanto à melhor abordagem terapêutica. Ainda não existe cura e os tratamentos oferecidos atuam na redução dos sintomas.[7]
Recentemente, tratamentos orais de reposição de agentes nutracêuticos possuem recomendação científica fraca. Esse tratamento complementar se apoia no uso de nutrientes produzidos laboratorialmente para reforçar a cartilagem articular e, assim, retardar ou prevenir a evolução da doença.[6]
Nesse contexto, destaca-se o colágeno hidrolisado, obtido a partir reação de hidrólise das fibras ou pó de colágeno bruto, sendo comprovadamente importante na manutenção e reconstituição da pele, ossos, cartilagem e matriz extracelular. Seguro e com efeitos adversos mínimos, sua composição de aminoácidos é rica em prolina, que se acumula preferencialmente na cartilagem e tem efeito condroprotetor.[6] Fatores como envelhecimento e má alimentação podem afetar a demanda de colágeno no corpo, contribuindo para o risco de disfunções ósseas e articulares e a eventual necessidade de suplementação alimentar.[5]
[7]
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Para além do colágeno, seus fragmentos peptídicos podem ser isolados através de hidrólise enzimática.[6] Os peptídeos de colágeno possuem propriedades bioativas e são capazes de direcionar a produção de proteínas específicas, eliminar radicais livres, prevenir a oxidação lipídica e atuar como quelantes para metais de transição. Desta forma, são utilizados como suplemento alimentar, sobretudo no combate ao envelhecimento da pele e na prevenção da osteoporose.[9]
Há trabalhos que demonstram a função dos nutracêuticos, comparando o tempo de evolução e/ou prevenção da lesão condral (LC) entre dois grupos de pacientes com LC em joelho, o primeiro sendo submetido ao uso de ácido hialurônico por via oral e um programa de exercícios, e o segundo submetido apenas aos exercícios físicos. Após 1 ano de acompanhamento, foi observado um desfecho diferente para o primeiro grupo, com sintomatologia mais discreta e menor uso de analgésicos.[10]
[11]
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Assim, este trabalho avalia os efeitos do colágeno hidrolisado e do peptídeo de colágeno no tratamento da LC induzida na cartilagem articular de joelhos de ratos após 30 dias da lesão tecidual.
Método
Aspectos Éticos
A presente pesquisa seguiu os preceitos da a legislação nacional em vigor para a criação e uso de animais (Lei Federal n° 11.794, de 2008) e as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. O anteprojeto de pesquisa foi submetido à aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade do Estado do Pará (UEPA), protocolo n° 09/2019.
Tipo de Estudo
Este é um estudo experimental, no qual foram utilizados 18 Rattus norvegicus, da linhagem Wistar, machos, com peso de ± 240g, e 120 dias de idade, provenientes do biotério do Instituto Evandro Chagas. Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas e mantidos em ambiente controlados de temperatura, umidade, luminosidade e ruídos.
Os animais foram distribuídos em três grupos de6 animais cada: grupo controle (GC); grupo peptídeo de colágeno (GPC); e grupo colágeno hidrolisado (GCH). As doses dos medicamentos para cada grupo foram baseadas em trabalhos prévios publicados na literatura.[10]
[11]
[12]
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Procedimentos cirúrgicos
O dano articular foi induzido através do ligamento patelar por uma única infiltração intra-articular de solução contendo 2 mg de iodoacetato de sódio, em um volume total de 25 μL, na articulação do joelho direito dos ratos previamente anestesiados, com o joelho em flexão um ângulo de 90 graus, utilizando uma agulha de 26G X 3/8 de calibre.
Tratamento
A anestesia realizada nos animais para posterior infiltração no joelho foi feita por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina nas doses de 70mg/kg e 7mg/kg, respectivamente.[14] Nos casos em que foi necessária a utilização de reforço, este foi aplicado pela via intramuscular e a dose foi ¼ da dose inicial.
Após a indução da lesão articular, todos os animais receberam analgesia com tramadol na posologia de 2mg/Kg, via intraperitoneal e mantidos em gaiolas identificadas por grupos, com ração e água ad libitum, durante 30 dias.
No GC (n = 6): os animais soram submetidos à indução da LC, sem nenhum tratamento administrado.
No GPC (n = 6): os animais foram submetidos à indução da LC e ao tratamento com peptídeo de colágeno (0,16g/kg/dia) por gavagem.
No GCH (n = 6): os animais foram submetidos à indução da LC e ao tratamento com colágeno hidrolisado (0,14g/kg/dia) por gavagem.
O veículo utilizado para a diluição dos componentes do presente estudo foi água purificada. Os pesos dos ratos foram aferidos diariamente, para eventuais ajustes de doses.
Processamento Histológico
Os animais foram submetidos a eutanásia por superdosagem anestésica. O joelho direito foi dissecado da região coxofemoral até a região do tornozelo, deixando a cápsula articular intacta. As amostras foram fixadas em formol a 10% e submetidas a análise histopatológica. Os joelhos foram mantidos nesta solução por 1 dia e foram desmineralizados em ácido nítrico a 5% por 2 a 3 dias. Estes tecidos foram, então, inseridos em blocos de parafina e secções tibiais foram preparadas e foram empregadas as colorações com hematoxilina-eosina e corante tricômio de Masson.
Para a análise histopatológica, foi realizada a contagem de condrócitos por cluster nas camadas superficial e intermediária; e utilizada a classificação Osteoarthritis Cartilage Histopathology Assessment System (OARSI), no qual a profundidade da lesão é classificada em seis graus e a extensão da lesão na superfície articular, em quatro estágios, conforme exposto na [Fig. 1].
Fig. 1 Análise histopatológica. Grupo 1: normalidade da cartilagem articular. Grupo 2: descontinuidade da superfície articular. Grupo 3: formação de fissuras ou fendas na superfície articular. Grupo 4: presença de erosão na superfície da cartilagem articular. Grupo 5: desnudamento da cartilagem articular. Grupo 6: deformação do osso subcondral (reproduzido de Pritzker et al., 2006).
O estágio de LC foi determinado de acordo com a extensão da lesão sobre a cartilagem articular, conforme descrito na [Tabela 1].
Tabela 1
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Estágio
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% de envolvimento (superfície, área, volume)
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Estágio 0
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Sem atividade
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Estágio 1
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< 10%
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Estágio 2
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10–25%
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Estágio 3
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25–50%
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Estágio 4
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> 50%
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Após a obtenção dos grupos e estágios da lesão, estes dados foram cruzados em uma tabela para a gradação de um escore padronizado disponível na [Tabela 2].
Tabela 2
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Graus
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Estágios
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E1
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E2
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E3
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E4
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G1
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1
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2
|
3
|
4
|
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G2
|
2
|
4
|
6
|
8
|
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G3
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3
|
6
|
9
|
12
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G4
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4
|
8
|
12
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16
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G5
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5
|
10
|
15
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20
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G6
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6
|
12
|
18
|
24
|
Como teste de normalidade, foi utilizado o de Kolmogorov-Smirnov. Os dados obtidos no estudo foram submetidos à análise estatística por meio do teste Kruskall-Wallis e, à presença de diferença estatisticamente significativa, foi empregado o teste de Student-Newman-Keuls, adotando-se como nível de significância α = 0,05. Para tanto, foi utilizado o software BioEstat 5.4.
Foram utilizados os softwares Word 2016 (Microsoft Corp., Redmond, WA, EUA) para a confecção do texto do trabalho, Excel 2016 (Microsoft Corp., Redmond, WA, EUA) para a organização e confecção de tabelas e gráficos e PowerPoint 2016 (Microsoft Corp., Redmond, WA, EUA) para a confecção da apresentação de diapositivos.
Resultados
Os resultados obtidos a partir do sistema OARSI foram elencados na [Tabela 3]. Inicialmente foi verificada a normalidade dos dados pelo Teste de Lilliefors demostrando uma distribuição não paramétrica, fazendo-se necessária a aplicação do Teste de Kruskal Wallis, em que se observou uma diferença estatisticamente relevante entre os grupos (p = 0,0008), confirmado com o teste de Student-Newman-Keuls.
Tabela 3
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Ratos
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Controle
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Colágeno hidrolisado
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Peptídeo de colágeno
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Grupo
|
Estágio
|
Escore
|
Grupo
|
Estágio
|
Escore
|
Grupo
|
Estágio
|
Escore
|
|
R1
|
2
|
1
|
2
|
2
|
1
|
2
|
2
|
1
|
2
|
|
R2
|
4
|
1
|
4
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
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R3
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3
|
1
|
3
|
2
|
1
|
2
|
2
|
1
|
2
|
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R4
|
2
|
2
|
4
|
1
|
1
|
1
|
2
|
1
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2
|
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R5
|
4
|
1
|
4
|
2
|
1
|
2
|
2
|
1
|
2
|
|
R6
|
2
|
2
|
4
|
2
|
1
|
2
|
2
|
1
|
2
|
|
Média
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2,83
|
1,33
|
3,5
|
1,66
|
1
|
1,66
|
1,83
|
1
|
1,83
|
Segundo os critérios do OARSI, proposto por Pritzker et al.,[15] nota-se correspondência entre os ratos de GC, GCH e GPC (p < 0,05) e diferença estatística entre CH e PC (p = 0,3632) ([Fig. 2]).
Fig. 2 Gráfico estabelecendo correspondência entre os grupos de LC e os ratos de cada grupo (p < 0,05 para todos os grupos; p = 0,3632 para GCH vs. GPC).
Ao observar os estágios de lesão, não foi observada significância estatística entre os grupos (p = 0,11) ([Fig. 3]).
Fig. 3 Gráfico estabelecendo correspondência entre os estágios de LC dos ratos de cada grupo (GC, GCH e GPC) (p = 0,11).
Com relação aos escores, houve significância estatística na comparação de GCH e GPC (p < 0,05), em relação ao GC ([Fig. 4]). Os escores dos grupos de colágeno hidrolisado e peptídeo de colágeno tiveram 1,66 e 1,83, respectivamente, e o GC teve escore de 3,5.
Fig. 4 Gráfico estabelecendo correspondência entre os escores de LC dos ratos de cada grupo (GC, GCH, e GPC) (p < 0,05).
A [Tabela 4] apresenta o quantitativo de condrócitos por cluster nas camadas superficial e intermediária da cartilagem.
Tabela 4
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Zona da cartilagem
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Grupo de controle
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GCH
|
GPC
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Superficial 12h
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2 a 3
|
3 a 4
|
3 a 4
|
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Intermediária 12h
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4 a 5
|
4 a 5
|
4 a 5
|
Discussão
A literatura sustenta o efeito benéfico da administração oral de colágeno hidrolisado na melhora de doenças articulares. Um estudo clínico, randomizado, duplo-cego demonstrou que a administração de 5 g de peptídeos de colágeno duas vezes ao dia em pacientes com LC de joelho promoveu redução estatisticamente significativa nos escores do Western Ontario McMaster Universities Osteoarthritis Index (WOMAC), questionário de qualidade de vida específico desses pacientes.[15]
No presente estudo, houve melhora na gradação da lesão induzida em joelho, indicando que os compostos chegaram até os condrócitos com reconhecimento adequado pelas proteínas de superfície destas células. O acúmulo de colágeno hidrolisado nas articulações de camundongos já foi demonstrado na literatura; sua ação benéfica possivelmente está associada ao estímulo do metabolismo de condrócitos, por meio do qual a biossíntese de colágeno é ativada.[7]
Em relação à contagem dos condrócitos em clusters nas camadas superficial e profunda da cartilagem articular, não houve diferença entre os grupos em estudo, à exceção do GC, cuja camada superficial apresentou diminuição na contagem. Este achado contrapõe a literatura, segundo a qual o padrão histológico clássico da cartilagem sob os efeitos da lesão articular inclui o aumento dos clusters celulares em tamanho e em número.[7]
[16]
[17] Uma possível justificativa reside no modelo experimental de indução de lesão utilizado. O fato de um agente externo causar o dano articular – não sendo intrínseco do balanço entre anabolismo e catabolismo da cartilagem – pode ter gerado a discrepância. Além disso, embora a apoptose em si seja também componente da resposta local à lesão, é possível que a diminuição da contagem esteja relacionada à apoptose, seja como fator indutor, seja como produto da degeneração osteoarticular.
Houve diferença estatisticamente significativa na classificação de grupos histológicos e escores de lesão (p < 0,05). O resultado sugere retardo do processo inflamatório inerente e estabilização da degradação da matriz extracelular associada ao aumento da síntese de seus componentes pelos condrócitos. Um estudo experimental em modelos de condrócitos bovinos e humanos afirma que o tratamento com colágeno hidrolisado inibiu a produção de mediadores inflamatórios (a exemplo, óxido nítrico e prostaglandina E-2), mesmo na presença de citocinas pró-inflamatórias (interleucina β-2); diminuiu a produção de metaloproteinases (degradantes da matriz extracelular) e diminuiu a expressão da enzima ciclo-oxigenase-2, sendo que a expressão destes resultados se deu de forma mais intensa nos condrócitos humanos.[18]
[19]
Por outro lado, uma metanálise por Bakilan et al.[20] concluiu inexistir evidências de que o colágeno hidrolisado administrado por via oral possa diminuir a destruição da cartilagem. Destaca-se, no entanto, que foram considerados somente ensaios clínicos. Os próprios autores afirmam, no mesmo trabalho, que o colágeno tipo II oral é um novo tratamento com o potencial de prevenir destruição articular, dor e perda de função, necessitando de estudos mais robustos.[18]
[21]
[22]
Não houve diferença entre os resultados apresentados pelo tratamento do GCH e do GPC, em conformidade com as conclusões de Kumar et al.,[23] em um ensaio clínico randomizado. Afirma-se, portanto, que apesar da origem dos peptídeos de colágeno, a eficácia permanece a mesma para os experimentos deste estudo.
Em humanos, a redução da dor indiretamente indica a melhora nas condições das articulações dos pacientes com LC em joelho, podendo estar associada com o início de processo de reparo por acumulação de peptídeo de colágeno no tecido cartilaginoso. O colágeno acumulado ajuda a manter a estrutura e função da cartilagem.[24]
No que diz respeito ao estágio (extensão) da lesão, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. De fato, mesmo entre os espécimes do GC, prevaleceu o estágio 1 de lesão. Este resultado pode ser interpretado em associação com achados de Spahn et al.,[24] ao evidenciarem, em estudo no qual se analisou defeitos da LC em joelhos humanos com espectroscopia e histopatologia, que a cartilagem circunjacente ao defeito observado, bem como do restante da articulação, já havia sido alterada mesmo com uma aparência intacta. Assim, embora sem alteração em extensão histologicamente considerável, toda a articulação é comprometida pela degeneração.[20]
Em estudos pré-clínicos, 24% dos pacientes com lesão articular que receberam de 5 a 7 g de colágeno hidrolisado por via oral tiveram melhora substancial com total ausência de dor e 44% indicaram melhoria notável.[11] Apesar dos resultados interessantes e sem a descrição de efeitos colaterais, não foi relatada nenhuma análise estatística no trabalho.[11] Foram encontradas poucas descrições de efeitos colaterais em humanos quando utilizadas doses acima de 10 g/dia, sendo que as mais encontradas foram cefaleia e distúrbios gastrointestinais leves, não contraindicando uso quando presentes.
Não é possível concluir se o efeito da administração oral de colágeno é eficaz para os casos em que há maior desgaste da superfície articular. Porém, pesquisas pré-clínicas apontam que os efeitos da suplementação de colágeno na melhora da lesão articular são dose e tempo-dependentes. Em face disto, futuras investigações podem contribuir para a elucidação destes dados, com maior tempo de tratamento sendo empregado para que a evolução da doença a longo prazo, com as intervenções terapêuticas em questão, seja avaliada objetivamente.
Conclusão
O tratamento proposto da LC induzida com uso de colágeno hidrolisado e peptídeos de colágeno por via oral mostrou-se eficaz, com estabilização ou regressão da lesão apresentada em ratos, merecendo novas pesquisas experimentais com o intuito de compreender e melhorar o desfecho primário deste trabalho.
