Palavras-chave
modelos animais - membrana induzida - osso e ossos - regeneração óssea - técnica de Masquelet
Introdução
Os defeitos segmentares críticos são definidos como uma falha óssea segmentar com comprimento 2 a 2,5 vezes maior do que o diâmetro do osso e que não regeneram espontaneamente.[1]
[2] Defeitos com essas dimensões são lesões complexas de difícil abordagem e representam um desafio para o ortopedista.[3] Em animais, um defeito ósseo crítico é definido como um defeito que não regenera espontaneamente ou que apresenta menos de 10% de regeneração óssea ao longo da vida do animal.[4]
As principais estratégias terapêuticas para os defeitos segmentares críticos são a distração osteogênica ou o transporte ósseo interno com fixador externo (técnica de Ilizarov),[5] os enxertos ósseos vascularizados[6] e a técnica da membrana induzida descrita por Alain Masquelet.[7]
[8]
Inicialmente, a técnica cirúrgica de Masquelet foi descrita para o tratamento das perdas ósseas secundárias à infecção e passou a ser progressivamente utilizada na reconstrução dos defeitos ósseos críticos. Na técnica, realizada em dois tempos, é feito o desbridamento da lesão com colocação do espaçador temporário (cimento) no primeiro tempo e, após cerca de seis semanas, é realizada a reconstrução com enxerto ósseo.[7]
[8] O racional da técnica se baseia na formação de uma membrana fibrosa induzida pela resposta inflamatória do tipo corpo estranho em torno do cimento interposto no local da ressecção do osso.[9]
[10] No segundo tempo cirúrgico, o cimento é retirado e o material de enxertia é introduzido na câmara formada no local de defeito.[11]
[12]
Relatos da literatura já descreveram as propriedades biológicas da membrana induzida que favorecem a consolidação do defeito após a enxertia óssea.[8]
[13]
[14]
[15]
[16] Além da barreira mecânica à reabsorção do enxerto, a membrana é fonte de moléculas bioativas como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), responsável pela modulação do padrão de vascularização da membrana ao longo do tempo[14]
[17] e o fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1), relacionado com a regulação da proliferação e diferenciação de condrócitos e osteoblastos na membrana.[15]
[17]
[18]
[19]
O objetivo deste estudo foi reproduzir em um modelo animal a técnica cirúrgica de Masquelet e analisar ao longo do tempo as características da membrana induzida formada em torno do cimento ósseo. No contexto da pesquisa ortopédica, o modelo poderá contribuir para (i) identificar achados relacionados com o favorecimento das condições locais para a consolidação óssea e (ii) possibilitar a realização de experimentos com novos materiais utilizados para o preenchimento inicial ou na reconstrução dos defeitos.
Materiais e Métodos
Animais
Utilizamos neste estudo 21 ratos Sprague-Dawley machos com 12-14 semanas e peso médio de 350 g, adquiridos no Biotério Central da Unicamp (Campinas, São Paulo). Os animais foram alojados em ambiente com luz e temperatura controladas e receberam ração e água ad libitum. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes publicadas na Lei 11.794 que regulamenta os procedimentos para o uso científico de animais e com a aprovação do comitê institucional de cuidados com animais (CEUA 006/2017).
Modelo Experimental
O procedimento cirúrgico foi realizado após indução anestésica em câmara com concentração alveolar de isoflurano (Biochimico, Itatiaia, Rio de Janeiro) de 4-5%. A seguir o animal foi transferido para máscara facial e mantido com concentração de 2,5% (Vaporizador Universal, Insight Ltda, Ribeirão Preto, São Paulo). A analgesia foi realizada com 5 mg/kg de cloridrato de tramadol (Hipolabor, Sabará, Minas Gerais) associado a 5 mg/kg cetoprofeno (Ketoprofeno 1%, Vencofarma, Londrina, Paraná) por via subcutânea no pré-operatório e mantida com dose diária por três dias consecutivos no pós-operatório. A antibioticoterapia profilática foi realizada com uma dose diária de 50 mg/kg de cefazolina sódica (Fazolon®, Blau Farmacêutica, São Paulo) por via intraperitoneal por três dias consecutivos. Após a cirurgia os animais foram mantidos individualmente em estantes ventiladas.
As cirurgias foram realizadas em condições estéreis com o animal em decúbito lateral esquerdo. Após tricotomia e assepsia do membro posterior direito com etanol 70%, foi realizada incisão cutânea longitudinal de 40 mm na face lateral da coxa. Após a incisão da fáscia lata, o músculo vasto lateral foi divulsionado para exposição do fêmur direito ([Fig. 1A]). Para criação do defeito foi realizada ostectomia de 10 mm na porção central da diáfise femoral com o auxílio de serra de Gigli com 0,22 mm de espessura (RISystem AG, Landquart, Suiça) ([Fig. 1B]).
Fig. 1. Etapas do procedimento cirúrgico para criação de defeito crítico na diáfise femoral em modelo animal e reconstrução com cimento ósseo. (A) Exposição do fêmur por acesso anterolateral e demarcação do local da criação do defeito crítico com gancho duplo na porção médio-diafisária. (B) Ostectomia (10 mm) realizada na porção central da diáfise com o auxílio de serra de Gigli (seta). (C) Inserção de fio de Kirschner (1,5 mm) através do canal medular do segmento ósseo distal em direção ao joelho. (D) Após a visualização da extremidade do fio na fossa intercondílea, com auxílio de um motor manual o fio foi progredido retrogradamente pelo canal medular através da falha óssea. (E) Ancoramento do fio na região trocantérica do fêmur e delimitação do defeito crítico. (F) Estabilização do defeito com a interposição de um espaçador cirúrgico de cimento ósseo (PMMA).
Após a ressecção da porção central da diáfise foi inserido um fio de Kirschner com ponta rosqueada e espessura de 1,5 mm através do canal medular do segmento ósseo distal em direção ao joelho ([Fig. 1C]). Após a luxação da patela e a visualização da extremidade do fio na fossa intercondílea, com auxílio de um motor manual, o fio foi progredido retrogradamente pelo canal medular através da falha óssea ([Fig. 1D]) e ancorado pela rosca na região trocantérica do fêmur ([Fig. 1E]). O tamanho da falha foi confirmado com um afastador de gancho duplo. A estabilização do defeito foi obtida com a interposição de um espaçador cirúrgico de cimento ósseo (polimetilmetacrilato, PMMA) preparado em capela de exaustão com a mistura de 1 g de polimetilmetacrilato com 487 μL de líquido ativador (Smartset GMV Endurance, Gentamicin in Bone Cement, DePuy International, Leeds, Inglaterra) ([Fig. 1F]). Uma vez iniciado o processo de polimerização, o PMMA foi moldado sobre a falha óssea e, após a secagem, foi feita sutura por planos.
Os animais foram eutanasiados duas, quatro e seis semanas após a cirurgia com injecçaão intravenosa de solução saturada de KCl sob efeito de anestesia inalatória profunda. Após a eutanásia foram realizadas radiografias do membro posterior direito na incidência em perfil para avaliar o tamanho do defeito, o alinhamento e a estabilidade da osteossíntese. O tamanho dos defeitos ósseos foi medido utilizando programa de processamento de imagem radiográfica (mDicomViewer, Microdata versão 3.0).
Análise histológica
Após a eutanásia, o membro posterior direito foi desarticulado no quadril, os tecidos moles foram removidos e o fêmur foi exposto. As membranas recobrindo o PMMA foram retiradas com auxílio de pinça e bisturi e fixadas sobre papel de filtro em formol tamponado a 10% (pH 7,4). Após 48 horas foram seccionadas em fragmentos longitudinais, incluídos em blocos de parafina para obtenção de cortes histológicos com 5 µm de espessura e, posteriormente, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina (H&E) ([Fig. 2]). As imagens foram obtidas no sistema ApoTome 2 em câmera de alta resolução AxioCam HRm (Zeiss Axiozoom v.16, Carl Zeiss, Munique, Alemanha) e digitalizadas no programa de análise Zeiss Zen 2 core (Carl Zeiss).
Fig. 2. Após a fixação em formol tamponado a 10% por 48h as membranas foram seccionadas em fragmentos longitudinais equidistantes, incluídas em parafina e coradas pela técnica da Hematoxilina-Eosina (H&E).
A medida da espessura foi obtida em pontos equidistantes em toda a extensão das membranas utilizando o software Image J (disponível gratuitamente no site https://imagej.nih.gov/ij/). Os graus de maturação do tecido conjuntivo (frouxo, denso e muito denso) e a vascularização (baixa, intermediária e alta) das membranas foram definidos por avaliação semi-quantitativa.
Análise estatística
Os tamanhos dos defeitos e a espessura das membranas em micra foram expressos em média ± desvio padrão e comparados utilizando o ANOVA one way seguido de pós teste de Holm-Sidak's. Foram considerados significativos valores para p < 0,05. As análises foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism versão 8.3 para iOS (Home-graphpad.com).
Resultados
Procedimento cirúrgico
As cirurgias tiveram duração média de 32 minutos. Apesar dos animais apresentarem algum grau de claudicação após a recuperação anestésica, eles se mantiveram ativos durante o período experimental. Ao final do terceiro dia, após a suspensão dos esquemas de analgesia e antibioticoterapia, os animais recuperaram a funcionalidade do membro operado.
Controle radiográfico
O tamanho médio dos defeitos ósseos foi 7 ± 1,5 mm. Nenhum animal apresentou deslocamento do cimento ósseo ou infecção no sítio cirúrgico. Em dezoito animais a osteossíntese garantiu a estabilidade dos segmentos ósseos, com boa sobreposição do PMMA inserido ao longo do defeito ([Fig. 3]). Três animais que apresentaram sinais de falha da osteossíntese por perda do ancoramento trocantérico ([Fig. 4]) foram submetidos a eutanásia e excluídos do estudo.
Fig. 3. Radiografias em perfil do membro posterior realizadas após a eutanásia para avaliar o tamanho do defeito, o alinhamento e a estabilidade da osteossíntese.
Fig. 4. Radiografias em perfil do membro posterior dos animais que apresentaram falha da osteossíntese por perda do ancoramento trocantérico. (A) Deslocamento completo do fio de Kirschner e soltura do espaçador. (B e C) Deslocamento parcial do fio de Kirschner com soltura do espaçador.
Morfologia das membranas
Em todos os animais as membranas envolviam completamente o espaçador de PMMA ([Fig. 5]). Microscopicamente, a porção superficial em contato com o cimento era representada por camada densamente celular ([Fig. 6]). Apesar da nítida delimitação entre o revestimento celular e a porção fibrosa superior da membrana, não havia evidência da presença de membrana basal.
Fig. 5. Aspecto macroscópico da membrana induzida de Masquelet em modelo murino com a face brilhante relacionada com o espaçador de polimetilmetracrilato (PMMA) voltada para cima (retângulo pontilhado).
Fig. 6. Microfotografia da membrana induzida de Masquelet em modelo murino quatro semanas após a criação de defeito crítico no fêmur. Revestimento da superfície em contato com o com o espaçador de polimetilmetracrilato (PMMA) representado por camada densamente celular, com interface (setas) bem definida da porção superior da membrana. Coloração H&E. Barra = 150μm.
A densidade do tecido conjuntivo alterou ao longo do tempo ([Tabela 1]). Em duas semanas, as membranas eram representadas por tecido de granulação ou conjuntivo ricamente vascularizado com deposição de matriz extracelular amorfa relacionada com fibroblastos jovens ([Fig. 7A]). A partir da quarta semana os fibroblastos são alongados e a matriz extracelular adquire aspecto fibrilar ([Fig. 7B]). Com seis semanas o tecido conjuntivo é rico em fibroblastos alongados e matriz colágena densa ([Fig. 7C]). Exceto pelo discreto aumento da espessura da parede dos vasos na avaliação mais tardia, o padrão da neoformação vascular não mostrou relação com o tempo ([Tabela 1]).
Fig. 7. Microfotografia das membranas induzidas ilustrando as características do tecido conjuntivo fibroso duas, quatro e seis semanas após a criação de defeito crítico no fêmur. (A) Duas semanas: tecido conjuntivo ricamente vascularizado associado com matriz extracelular amorfa relacionada com fibroblastos jovens (seta), focos de hemorragia (h) e depósitos de fibrina (f). (B) Quatro semanas: vascularização exuberante (*) e matriz extracelular com aspecto fibrilar relacionada a fibroblastos com morfologia alongada. (C) Seis semanas: tecido conjuntivo rico em fibrobastos aprisionados em matriz colágena densa com fibras dispostas paralelamente (*). PMMA = polimetilmetacrilato. Coloração H&E. Barra = 200µm (A, B e C).
Tabela 1
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Parâmetro
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2 semanas
(n = 6)
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4 semanas
(n = 6)
|
6 semanas
(n = 6)
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Densidade do conjuntivo da membrana
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frouxo
denso
muito denso
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2 (33%)
3 (50%)
1 (17%)
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0 (0%)
4 (67%)
2 (33%)
|
0 (0%)
1 (17%)
5 (83%)
|
|
Vascularização
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baixa
intermediária
alta
|
1 (17%)
0 (0%)
5 (83%)
|
1 (17%)
0 (0%)
5 (83%)
|
0 (0%)
4 (67%)
2 (33%)
|
A espessura das membranas aumentou significativamente ao longo do tempo ([Fig. 8]). Com seis semanas as membranas tinham espessura média de 565 ± 208 μm e, na maior parte dos animais o tecido conjuntivo penetrava o músculo esquelético subjacente, promovendo o ancoramento da membrana no local do defeito ósseo ([Fig. 9]). Com quatro e duas semanas a expessura média foi respectivamente 186,9 ± 70,21 e 252,2 ± 55,1 μm.
Fig. 8. Relação entre temporalidade e espessura das membranas. Valores expressos como média ± desvio padrão. ANOVA one way seguido de pós teste de Holm-Sidak's.
Fig. 9. Na avaliação mais tardia (seis semanas) o tecido conjuntivo da membrana (setas) penetra no músculo esquelético (ME) subjacente promovendo o ancoramento da membrana no local do defeito ósseo e atrofia das fibras musculares esqueléticas (*). PMMA = polimetilmetacrilato. Coloração H&E. Barra = 200µm
Quanto ao potencial intrínseco para diferenciação osteogênica, todas as membranas avaliadas no tempo inicial de duas semanas (6/6) mostraram focos de ossificação endocondral. Ao longo do tempo este potencial reduziu progressivamente (4/6 com quatro semanas e 1/6 com seis semanas). Independente do ponto de observação, a neoformação óssea ocorreu em todas as regiões da membrana, sem definição de um padrão preferencial de localização ([Fig. 10]). Em algumas membranas havia associação do osso neoformado com células hematopoéticas.
Fig. 10. Potencial intrínseco das membranas para indução de diferenciação osteogênica. (A) Foco de ossificação endocondral (OE) localizado próximo à superfície da membrana. Condrócitos proliferativos e hipertróficos (*) podem ser identificados em relação com a formação óssea (duas semanas). (B) Foco de ossificação localizado próximo ao plano muscular (ME) constituído por osso lamelar (OL) e não lamelar imaturo (OI) e células hematopoéticas (*) (4 semanas). (C) Foco de ossificação endocondral (OE) localizado próximo a superfície da membrana constituído por osso imaturo contendo osteoblastos aprisionados na matriz óssea e células hematopoéticas (*). PMMA = polimetilmetacrilato. ME = Músculo esquelético Coloração H&E. Barra = 100µm (A e B) e 50μm (C).
Discussão
Neste estudo estabelecemos um modelo murino de falha óssea médio-diafisária no fêmur com a colocação de haste intramedular retrógrada (fio de Kirschner rosqueado) a fim de mimetizar a técnica de Masquelet. Modelos animais que mimetizam a situação clínica são particularmente interessantes para teste de estratégias de bioengenharia ortopédica baseadas no desenvolvimento de substitutos ósseos. No nosso modelo, reproduzimos a formação da membrana e mostramos o seu potencial intrínseco para diferenciação osteogênica e a organização e maturação do tecido conjuntivo ao longo do tempo.
O tecido de granulação e a matriz extracelular das membranas dos tempos iniciais se torna progressivamente mais denso e rico em fibras colágenas espessas. Em coelhos[19] e ovelhas[13] não foram observadas alterações estruturais relacionadas com o envelhecimento da membrana. Contudo, em um dos principais estudos clínicos desenvolvido para investigar a biologia das membranas, com o tempo, o tecido conjuntivo se tornou mais colagenizado e menos vascularizado atingindo sua composição final três a seis meses depois da colocação do espaçador.[14] A partir da segunda semana após o procedimento cirúrgico observamos em todos os animais a formação de membrana fibrosa envolvendo o espaçador. Diversos relatos confirmam a semelhança morfoestrutural da membrana formada em torno do PMMA em humanos e em animais.[12] Em ambos os cenários ela é constituída por tecido conjuntivo bem estruturado organizado em camadas.[15]
[20] A porção superficial da membrana em contato com o cimento é revestida por células poliédricas dispostas em camadas, semelhante aos revestimentos epiteliais.[8] As camadas subsequentes são constituídas por fibroblastos, miofibroblastos, e matriz extracelular rica em colágeno tipo I.[8]
[15]
[16]
[19]
[21]
A não ser pelo espessamento da parede vascular, não observamos influência do tempo sobre a vascularização da membrana. Apesar da vascularização reduzir a medida que a membrana se torna mais colagenizada,[14] é possível que a forma de avaliação comparativa que utilizamos para quantificar a densidade dos vasos não tenha confirmado este achado. A redução de 60% da vascularização do primeiro para o terceiro mês foi descrita em fragmentos da membrana obtidos por biópsias sequenciais realizadas no mesmo paciente.[14] Outro ponto a ser considerado é que, em geral a avaliação do padrão de vascularização é feita após a reconstrução do defeito.[20] Possivelmente a enxertia óssea interfere na dinâmica de remodelação das membranas dificultando a comparação com membranas formadas antes da reconstrução do defeito.
Os relatos quanto a espessura da membrana em modelos animais, variando entre 100-200μm[16]
[20]
[22]
[23] a 1000 μm[17]
[19] estão de acordo com a faixa de valores obtidos no presente estudo. Como outros autores,[17]
[18]
[23]
[24] observamos que as membranas se tornaram mais espessas ao longo do tempo, que pode ser justificado pelo maior acúmulo de tecido conjuntivo e de fibras colágenas espessas. Estudos realizados em ratos[22] e em coelhos[17]
[20] mostram que, com o tempo, a membrana se torna mais delgada. Em nenhum desses estudos os autores sugerem as bases biológicas/biomecânicas para justificar os seus resultados. À semelhança do padrão de vascularização é possível que esta discrepância esteja relacionada com a obtenção de valores da espessura da membrana antes e depois do segundo procedimento cirúrgico. Um resultado adicional do nosso estudo observado tardiamente foi a extensão do tecido conjuntivo das membranas para o músculo esquelético. As vantagens e desvantagens da fixação local da membrana podem vir a ser tema de investigações futuras em estudos clínicos voltados para a definição do melhor momento para realizar o segundo procedimento cirúrgico da técnica de Masquelet.
O potencial intrínseco das membranas para diferenciação osteogênica demonstrado no presente estudo e em membranas humanas[14]
[25] e de animais[16]
[18] reduziu ao longo do tempo.[14]
[16]
[18]
[24]
[26] O tecido de granulação formado nas fases iniciais do processo induzido por grandes corpos estranhos é rico em estroma mesenquimal indiferenciado e contem células que expressam marcadores de pluri e de multipotencialidade.[27] Esta composição confere elevado potencial local para diferenciação nas linhagens mesenquimais, justificando a neoformação óssea em todas as membranas avaliadas com duas semanas. A redução progressiva da população de progenitores mesenquimais, a medida que o tecido da membrana sofre maturação, explicaria o menor percentual de focos de osteogênese tardiamente.
A escolha pela fixação intramedular com fio de Kirshner conferiu estabilidade mecânica no local do defeito. Ocorreram três falhas de fixação (3 em 21 casos), decorrentes de erro técnico do ancoramento da rosca do fio na região trocantérica do fêmur. Existem outros implantes desenvolvidos para este fim, porém o alto custo inviabiliza a utilização em pesquisa básica no nosso meio. O modelo mostrou-se eficiente, simples, reprodutível e de baixo custo.
Uma limitação do nosso estudo foi não ter reproduzido o segundo procedimento cirúrgico da técnica de Masquelet. Outra limitação que pode ser corrigida em estudos futuros é a identificação de moléculas bioativas e de progenitores mesenquimais que atuam na regulação local da membrana, utilizando técnicas de biologia molecular e isolamento celular. Para assegurar a reprodutibilidade do modelo, um ponto crítico a ser observado durante a abordagem cirúrgica é a manutenção do espaço criado pela ostectomia até o final do processo de polimerização do PMMA.
Conclusão
Além da função estrutural e protetora da membrana, suas características biológicas intrínsecas podem contribuir ativamente para a consolidação do defeito. A atividade biológica atribuída pela presença de focos de osteogênese confere a membrana potencial de osteoindução que favorecem as condições locais para a integração do enxerto ósseo. O modelo proposto pode contribuir em pesquisas futuras voltadas para estudar esse microambiente favorável e potencializador da regeneração óssea.
