Induktion direkter antibakterieller Aktivität gegen Mycobacterium tuberculosis durch Toll-like-Rezeptoren

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Zusammenfassung

Das Immunsystem des Menschen besitzt mit den Toll-like-Rezeptoren (TLR) eine ontogenetisch sehr alte Familie von Rezeptoren, über die bereits die Fruchtfliege verfügt. Sie reagieren auf Signale von mikrobiellen Liganden. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Aktivierung von TLR2 zu einer Eliminierung des intrazellulären Bakteriums Mycobacterium (M.) tuberculosis auch in humanen Makrophagen führt. In Mausmakrophagen führt die Aktivierung von TLR2 durch bakterielle Lipoproteine zur Induktion eines Effektormechanismus, der durch Stickoxid-Radikale vermittelt wird. In humanen Monozyten und Alveolarmakrophagen hingegen ist das Abtöten von M. tuberculosis Stickoxid-unabhängig. Daher interagieren die TLR von Säugern ähnlich wie das Toll-Protein von Drosophila mit mikrobiellen Liganden und aktivieren am Ort der Infektion antimikrobielle Effektormechanismen.

Abstract

Drosophila, the toll gene controls a powerful innate defense system against bacteria and fungi. Conserved through evolution, the mammalian innate immune system retains a family of homologous Toll-like receptors (TLRs) that are activated by microbial ligands to release cytokines that instruct the adaptive immune responses. Here we show that TLR2 activation leads to killing of intracellular Mycobacterium (M.) tuberculosis in both mouse and human macrophages. In mouse macrophages, bacterial lipoprotein activation of TLR2 leads to a nitric oxide-dependent killing of intracellular tubercle bacilli. In human monocytes and alveolar macrophages, bacterial lipoproteins similarly activated TLR2 to kill intracellular M. tuberculosis, however by an antimicrobial pathway that is nitric oxide independent. TLR2+CD14+CD68+ macrophages were detected in human lesions of tuberculous lymphadenitis within granulomas and surrounding foci of necrosis. These data provide evidence that mammalian TLRs have retained not only the structural features of Drosophila Toll that allow them to respond to microbial ligands, but also the ability directly to activate antimicrobial effector pathways at the site of infection.

Einleitung

Das primitive Immunsystem von Drosophila hat eine erstaunlich hohe Wirksamkeit bei der Bekämpfung mikrobieller Krankheitserreger entwickelt, vorwiegend durch eine Familie von Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche, den Toll-Proteinen. Die Aktivierung von Toll durch mikrobielle Liganden induziert eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, die den Kernfaktor kB (NFkB) stimuliert, wodurch Gene transkribiert werden, die antimikrobielle Proteine kodieren [1] [2] [3]. Das Drosophila Toll-System wurde strukturell auch beim Menschen konserviert und ist der Familie der TLR bei Säugern homolog [4]. Mikrobielle Liganden, darunter Lipopolysaccharid (LPS) und bakterielle Lipoproteine, aktivieren die TLR der Säuger und führen dadurch zur Transkription von Genen, welche die erworbene Immunantwort regulieren, darunter Zytokine und kostimulatorische Moleküle [5] [6] [7] [8] [9]. Bislang blieb jedoch noch offen, ob die Aktivierung von TLR auch beim Säuger antimikrobielle Effektormechanismen bewirkt.

Methoden

Monozyten und Zelllinien

Für Experimente mit Mauszellen wurde die Makrophagenlinie RAW264.7 Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) verwendet. Humane Monozyten wurden nach Dichtegradienten-Zentrifugation von Blut gesunder Spender nach 90-minütiger Adhärenz und Abwaschen nicht-haftender Lymphozyten gewonnen. Durchfluss-zytometrische Analysen zeigten, dass diese Zellen zu über 95 % aus Monozyten bestehen. Alveolarmakrophagen wurden aus der bronchoalveolären Lavage von Patienten aufgereinigt, die aus anderen diagnostischen Gründen lavagiert wurden und nicht an einer Tuberkulose litten. Die Spülflüssigkeit wurde durch ein Zellsieb filtriert (Labor Schuberth, Amberg), um den Schleim und grobe Partikel zu entfernen. In einigen Experimenten wurden die adhärenten Zellen durch immunomagnetische Depletion von Lymphozyten (CD3, CD19, CD56) aufgereinigt. Die restlichen Zellen bestanden zu über 95 % aus Alveolarmakrophagen, wie durch α-Naphtyl-Azetat-Esterase Färbung (Sigma) gezeigt wurde.

Infektion mit M. tuberculosis

Makrophagen wurden mit M. tuberculosis (virulenter Stamm H37Rv) in einem Verhältnis von 5 Bakterien auf 1 Zelle (MOI 5) für vier Stunden infiziert wie beschrieben [10] [11]. Die Zellen wurden dann mit dem mikrobiellen Liganden 19-kD-Lipoprotein von M. tuberculosis [7] oder dem Tp47 von Treponema pallidum für 48 Stunden koinkubiert. Gegebenfalls wurden den Ansätzen Inhibitoren der iNOS (L-NIL, L-NAME, oder D-NAME) zugegeben. Für die Blockierungsexperimente wurden M. tuberculosis-infizierte Zellen mit ihrem Liganden in der Gegenwart monoklonalen Antikörpern gegen TLR2 (10 µg/ml) [7] [8], neutralisierenden TNF-Antikörpern (20 µg/ml, R&D Systems) oder einer Isotyp-Kontrolle bebrütet. Danach wurden die Zellen mit 0,3 % Saponin (Sigma, Deisenhofen) lysiert und die Anzahl koloniebildender Einheiten (CFU) durch Plattieren von vier Verdünnungen, jeweils in Duplikaten auf 7H11-Platten bestimmt.

Immunhistochemie

Lymphknotenproben wurden von 5 Tuberkulosepatienten entnommen. Immunperoxidase Färbung wurde mit monoklonalen TLR2-Antikörpern durchgeführt wie beschrieben [12].

Ergebnisse und Diskussion

Zunächst untersuchten wir, ob die Aktivierung von Mausmakrophagen durch bakterielle Lipoproteine die Überlebensfähigkeit von M. tuberculosis einschränkt. Das 19-kD-Lipoprotein von M. tuberculosis oder das Tp47-Lipopeptid von Treponema pallidum [7] verringerten die Anzahl lebendiger Mykobakterien in der Mausmakrophagen-Zelllinie RAW264.7 bis zu 70 % (Daten nicht gezeigt). Die Induktion der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) und die Freisetzung von Stickoxid (NO) stellen einen entscheidenden antimykobakteriellen Abwehrmechanismus von Mauszellen dar [13] [14] [15]. Da bakterielle Lipoproteine die Promotoraktivität von iNOS induzieren, stellten wir die Hypothese auf, dass die antimikrobielle Aktivität durch TLR-vermittelte Freisetzung von NO erfolgen könnte. Mit M. tuberculosis infizierte RAW-Zellen wurden mit dem 19-kD-Lipoprotein in der An- und Abwesenheit von pharmakologischen Inhibitoren der iNOS stimuliert und die Sekretion von NO sowie die antibakterielle Aktivität bestimmt. Wir fanden, dass die NO-Synthese in der Anwesenheit von L-N⁶-Iminoethyl-Lysin (L-NIL) oder L-N⁶- Nitro-Arginin-methylester (L-NAME) fast völlig unterdrückt wurde (Abb. [1a], links), jedoch nicht in der Anwesenheit von inaktivem Enantiomer D-NAME. Die Hemmung der NO-Produktion korrelierte mit der durch das 19-kD-Lipoprotein-induzierten antimikrobiellen Aktivität (Abb. [1a], rechts). Dies zeigt die Abhängigkeit von TLR-vermittelter antibakterieller Aktivität von der Verfügbarkeit von NO.

Um zu zeigen, dass die lipoproteininduzierte antimikrobielle Aktivität von der Aktivierung der TLR abhängt, untersuchten wir die Fähigkeit des 19-kD-Lipoproteins, in Peritonealmakrophagen von TLR2- oder TLR4-defizienten Mäusen eine antimikrobielle Aktivität zu induzieren. Die Experimente wurden mit nichtinfizierten und M. tuberculosis-infizierten (Abb. [1b]) Makrophagen durchgeführt. Primäre Peritonealmakrophagen von TLR2-defizienten Mäusen reagierten nur mit geringer NO-Produktion auf das 19-kD-Lipoprotein und die Variabilität der intrazellulären Bakterien wurde nicht wesentlich reduziert verglichen mit Wildtyp-Makrophagen (Abb. [1b]). Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Aktivierung von TLR2 in Mausmakrophagen zu einer NO-abhängigen Wachstumshemmung intrazellulärer Tuberkel führt.

Bislang ist unklar, ob humane Makrophagen antimikrobielle Aktivität durch NO vermitteln können. Wir wollten klären, ob die Stimulation von TLR zur NO-abhängigen Limitierung des mykobakteriellen Wachstums führt. Die Aktivierung humaner Monozyten mit bakteriellen Lipoproteinen reduzierte das intrazelluläre Wachstum von M. tuberculosis in vergleichbarem Ausmaß wie in Mausmakrophagen (Daten nicht gezeigt). Das Abtöten der intrazellulären Mykobakterien in humanen Monozyten war eindeutig abhängig von der 19-kD-vermittelten Aktivierung von TLR2, da monoklonale Antikörper gegen TLR2 [7] [8] den Effekt zu über 90 % inhibierten (Abb. [2a]). In Gegensatz zu Mausmakrophagen führte die Zugabe des NO-Inhibitors L-NIL nicht zur Verminderung der 19-kD-vermittelten antibakteriellen Aktivität. Diese Beobachtung korrelierte mit der fehlenden NO-Freisetzung durch humane Monozyten nach Inkubation mit dem 19-kD-Lipoprotein (Abb. [2b]). Dieser Befund wurde durch die Verwendung eines zusätzlichen Stimulus zur NO-Freisetzung erweitert, nämlich der Kombination aus Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und Interferon γ (IFN-γ) [16]. In der RAW-Zellen ergab sich nach Zugabe von TNF und IFN-γ eine gesteigerte Produktion von NO (Abb. [2b], links) und eine signifikant erhöhte antimikrobielle Aktivität (Abb. [2b], rechts). Das Ausmaß war vergleichbar mit der durch das 19-kD-Protein-induzierten Abtötung. Im Gegensatz dazu induzierten TNF und IFN-γ in humanen Makrophagen weder NO (Abb. [2b], links) noch eine antimykobakterielle Aktivität (Abb. [2b] rechts). Sie führten jedoch zu einer Freisetzung von Interleukin 12 (Daten nicht gezeigt). Obwohl TNF das Wachstum von avirulenten Mykobakterien in humanen Alveolarmakrophagen reduziert [17], fanden wir, dass die Wachstumsrate von virulenten Bakterien durch TNF in diesen Zellen sogar gesteigert wird [18]. Außerdem inhibierte die Zugabe von TNF-Antikörpern nicht die durch das 19-kD-Lipoprotein induzierte Wachstumhemmung von dem virulenten Bakterienstamm, der in unseren Experimenten verwendet wurde (Abb. [2c]). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Aktivierung von TLR2 in humanen Zellen einen effektiven antibakteriellen Abwehrmechanismus induziert, der unabhängig von TNF und NO ist.

Die Fähigkeit von Alveolarmakrophagen M. tuberculosis aufzunehmen und zu eliminieren stellt einen entscheidenden Abwehrmechanismus gegen Tuberkulose dar. Alveolarmakrophagen wurden aus der bronchoalveolären Lavage aufgereinigt, mit M. tuberculosis infiziert und mit dem 19-kD-Lipoprotein inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die Anzahl lebendiger Mykobakterien bestimmt (Abb. [3a]). Stimulation infizierter Alveolarmakrophagen mit Lipoprotein induzierte eine antimikrobielle Aktivität, die unabhängig von der NO-Freisetzung, aber abhängig von dem TLR2-Signal war. Konsistent mit dem Befund, dass der spezifische iNOS-Inhibitor L-NIL die antimykobakterielle Wirkung nicht hemmte, sezernierten infizierte Alveolarmakrophagen nach Stimulation mit 19-kD-Lipoprotein in vitro kein NO (Daten nicht gezeigt). Obwohl berichtet wurde, dass Alveolarmakrophagen iNOS exprimieren [19], zeigten unsere Daten, dass zusätzlich ein NO-unabhängiger Abwehr-Mechanismus existiert, der zur antibakteriellen Aktivität beiträgt. Die Expression von TLR2 auf der Oberfläche von Zellen aus der Monozyten/Makrophagen-Linie in tuberkulösen Herden in menschlichem Gewebe zeigt, dass die Aktivierung von TLR2 zur protektiven Immunabwehr am Ort der Infektion beitragen kann (Abb. [3b]).

Über hunderte von Millionen Jahren der Evolution hat das Immunsystem die Struktur der TLR wie auch den NFkB-Signaltransduktionsweg als einen Abwehrmechanismus der angeborenen Immunantwort beibehalten, um der Bedrohung durch mikrobielle Krankheitserreger zu begegnen. Die geschilderten Ergebnisse zeigen, dass sowohl humane als auch Mauszellen den TLR-Signalweg benutzen, über den antimikrobielle Effektormechanismen stimuliert werden. Allerdings sind die Effektormoleküle unterschiedlich: Während in Mäusen TLR-Aktivierung zu einer NO-abhängigen antibakteriellen Aktivität führt, ist der TLR-vermittelte Abwehrmechanismus beim Menschen NO-unabhängig. Bei Drosophila führt die Aktivierung von Toll zur Produktion einer Vielzahl antimikrobieller Peptide, darunter Metchnikowan, Defensine, Cecropine, und Drosomycin [1] [2] [3]. Unsere Arbeit lässt erwarten, dass eine genaue Untersuchung von TLR2-abhängigen Effektormechanismen in humanen Makrophagen Rückschlüsse auf die Wirkungsweise der angeborenen Immunität ermöglicht. Die Arbeiten über Drosophila deuten darauf hin, dass die Untersuchung der Induktion antimikrobieller Peptide in diesen Zellen fruchtbar sein kann. Erkenntnisse aus derartigen Studien ergeben neue Einblicke in die Immunantwort beim Menschen.

Abb. 1 Mikrobielle Lipoproteine inhibieren das Wachstum von M. tuberculosis.

(A) Das 19-kD-Lipoprotein von M. tuberculosis vermittelt eine NO-abhängige antimikrobielle Aktivität in RAW-Zellen. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) wurde 48 Stunden nach Infektion mit einer MOI von 5 ermittelt. Die Inhibitoren (L-NIL, 1mM; L-NAME, 2mM) wurden direkt nach der Pulsinfektion zusammen mit dem 19-kD-Lipoprotein (1 µg/ml) zu den Zellen gegeben. Die Abbildungen zeigen den Durchschnitt ± SEM von drei oder mehr unabhängigen Experimenten.

(B) Lipoproteininduziertes Abtöten von M. tuberculosis wird durch TLR2 vermittelt. Thioglykollatinduzierte Peritonealmakrophagen von Kontroll- (wt) und gendefizienten (TLR2 -/-) Mäusen wurden mit M. tuberculosis (MOI 5) infiziert. Die Produktion von NO (Griess Reaktion) und die Bakterienlast (Plattieren von Zell-Lysaten) wurde 48 Stunden nach der Zugabe des 19-kD-Lipoproteins (1 µg/ml) oder LPS (0,1 µg/ml) bestimmt. Die Abbildung zeigt den Durchschnitt aus Triplikaten eines Experimentes ± SEM.

Abb. 2 Humane Zellen töten M. tuberculosis über einen TLR2-abhängigen, aber NO-unabhängigen Mechanismus.

(A) Die Inhibierung von mykobakteriellem Wachstum in humanen Monozyten wird durch die Anwesenheit blockierender Antikörper gegen TLR2 (αTLR2) gehemmt, ist aber unabhängig von der NO-Freisetzung. Infizierte Monozyten (MOI 5) wurden mit αTLR2 (10 µg/ml) oder L-NIL (1mM) für 48 Stunden inkubiert und das intrazelluläre Wachstum wurde durch das Plattieren von vier Verdünnungen der Zell-Lysate, jeweils in Duplikaten, bestimmt.

(B) TNF und IFN-γ induzieren die Freisetzung von NO und antimikrobielle Aktivität in Mausmakrophagen, nicht aber in humanen Monozyten. TNF und IFN-γ (jeweils 10 ng/ml) wurden zu infizierten Mausmakrophagen (RAW) oder humanen Monozyten gegeben. Die Freisetzung von NO und die Bakterienlast wurden nach 48-stündiger Kultur bestimmt. Die Abbildungen zeigen den Durchschnitt von vier unabhängigen Experimenten ± SEM mit Zellen von verschiedenen Spendern.

(C) Die antimykobakterielle Aktivität des 19-kD-Lipoproteins ist TNF-unabhängig. Das 19-kD-Lipoprotein (2 µg/ml) und Antikörper gegen TNF (20 µg/ml) wurden wie in der Beschriftung angegeben pipettiert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden lysiert und die Anzahl der CFU bestimmt.

Abb. 3 TLR2 wird am Ort der Tuberkulose-Infektion beim Menschen exprimiert.

(A) Aktivierung von Alveolarmakrophagen durch das 19-kD-Lipoprotein reduziert das Überleben intrazellulärer Mykobakterien auf TLR2-abhängige, jedoch NO-unabhängige Weise. Alveolarmakrophagen wurden mit M. tuberculosis mit einer MOI von 2 für vier Stunden infiziert und danach das Lipoprotein (1 µg/ml) oder die Inhibitoren zugegeben. Das bakterielle Wachstum wurde nach 48 Stunden gemessen. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment mit Alveolarmakrophagen von vier unterschiedlichen Spendern. Die Daten sind als CFU ± SEM angegeben.

(B) zeigt die TLR2-Expression im Gewebe von Patienten mit Lymphknoten-Tuberkulose. Die Immunperoxidase-Färbung zeigt Bilder (40fache Vergrößerung) mit TLR2-Expression in Rot auf großen, ovalen Zellen innerhalb der Granulome, welche typisch für Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie sind.

Literatur

• 1 Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart J M, Hoffmann J A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.  Cell. 1996;  86 973-983
• 2 Lemaitre B, Reichhart J M, Hoffmann J A. Drosophila host defense: differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganismus.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;  94 14614-14619
• 3 Hoffmann J A, Kafatos F C, Janeway C A, Ezekowitz R A. Phylogenetic perspectives in innate immunity.  Science. 1999;  284 1313-1318
• 4 Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway Jr C A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity.  Nature. 1997;  388 394-397
• 5 Kirschning C J, Wesche H, Merrill Ayres T, Rothe M. Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide.  J Exp Med. 1998;  188 2091-2097
• 6 Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu M Y, Huffel C V, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos C, Freudenberg M, Ricciardi-Castagnoli P, Layton B, Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in TIr4 gene.  Science. 1998;  282 2085-2088
• 7 Brightbill H D, Libraty D H, Krutzik S R, Yang R B, Belisle J T, Bleharski J R, Maitland M, Norgard M V, Plevy S E, Smale S T, Brennan P J, Bloom B R, Godowski P J, Modlin R L. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors.  Science. 1999;  285 732-736
• 8 Aliprantis A O, Yang R B, Mark M R, Suggett S, Devaux B, Radolf J D, Klimpel G R, Godowski P, Zychlinsky A. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.  Science. 1999;  285 736-739
• 9 Underhill D M, Ozinsky A, Hajjar A M, Stevens A, Wilson C B, Bassetti M, Aderem A. The toll-like receptor-2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens.  Nature. 1999;  401 811-815
• 10 Stenger S, Mazzaccaro R J, Uyemura K, Cho S, Barnes P F, Rosat J P, Sette A, Brenner M B, Porcelli S A, Bloom B R, Modlin R L. Differential effects of cytolytic T-cell subsets on intracellular infection.  Science. 1997;  276 1684-1687
• 11 Stenger S, Hanson D A, Teitelbaum R, Dewan P, Niazi K R, Froelich C J, Ganz T, Thoma-Uszynski S, Melian A, Bogdan C, Porcelli S A, Bloom B R, Krensky A M, Modlin R L. An antimicrobial activity of cytolytic T-cells mediated by granulysin.  Science. 1998;  282 121-125
• 12 Jullien D, Sieling P A, Uyemura K, Mar N D, Rea T H, Modlin R L. IL-15, an immunomodulator of T-cell responses in intracellular infection.  J Immunol. 1997;  158 800-806
• 13 Chan J, Xing Y, Magliozzo R S, Bloom B R. Killing of virulent Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by activated murine macrophages.  J Exp Med. 1992;  175 1111-1122
• 14 MacMicking J D, North R J, LaCourse R, Mudgett J S, Shah S K, Nathan C F. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;  94 5243-5248
• 15 Vodovotz Y, Bogdan C, Paik J, Xie Q W, Nathan C. Mechanisms of suppression of macrophage nitric oxide release by transforming growth factor beta.  J Exp Med. 1993;  178 605-613
• 16 Stenger S, Solbach W, Rollinghoff M, Bogdan C. Cytokine interactions in experimental cutaneous leishmaniasis. II. Endogenous tumor necrosis factor-alpha production by macrophages is induced by the synergistic action of inferferon (IFN)-gamma and interleukin (IL) 4 and accounts for the antiparasitic effect mediated by IFN-gamma and IL 4.  Eur J Immunol. 1991;  21 1669-1675
• 17 Hirsch C S, Ellner J J, Russell D G, Rich E A. Complement receptor-mediated uptake and tumor necrosis factor-alpha- mediated growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis by human alveolar macrophages.  J Immunol. 1994;  152 743-753
• 18 Engele M, Stößel E, Castiglione K, Schwerdtner N, Wagner M, Bölcskei P, Röllinghoff M, Stenger S. Induction of Tumor Necrosis Factor in Human Alveolar Macrophages as a Potential Evasion Mechanism of Virulent Mycobacterium tuberculosis.  J Immunol. 2002;  in press
• 19 Nicholson S, Bonecini-Almeida M dG, Lapa e Silva J R, Nathan C, Xie Q W, Mumford R, Weidner J R, Calaycay J, Geng J, Boechat N. et al . Inducible nitric oxide synthase in pulmonary alveolar macrophages from patients with tuberculosis.  J Exp Med. 1996;  183 2293-2302