Einleitung
Das primitive Immunsystem von Drosophila hat eine erstaunlich hohe Wirksamkeit bei der Bekämpfung mikrobieller Krankheitserreger entwickelt, vorwiegend durch eine Familie von Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche, den Toll-Proteinen. Die Aktivierung von Toll durch mikrobielle Liganden induziert eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, die den Kernfaktor kB (NFkB) stimuliert, wodurch Gene transkribiert werden, die antimikrobielle Proteine kodieren [1 2 3 Drosophila Toll-System wurde strukturell auch beim Menschen konserviert und ist der Familie der TLR bei Säugern homolog [4 5 6 7 8 9
Methoden
Monozyten und Zelllinien
Für Experimente mit Mauszellen wurde die Makrophagenlinie RAW264.7 Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) verwendet. Humane Monozyten wurden nach Dichtegradienten-Zentrifugation von Blut gesunder Spender nach 90-minütiger Adhärenz und Abwaschen nicht-haftender Lymphozyten gewonnen. Durchfluss-zytometrische Analysen zeigten, dass diese Zellen zu über 95 % aus Monozyten bestehen. Alveolarmakrophagen wurden aus der bronchoalveolären Lavage von Patienten aufgereinigt, die aus anderen diagnostischen Gründen lavagiert wurden und nicht an einer Tuberkulose litten. Die Spülflüssigkeit wurde durch ein Zellsieb filtriert (Labor Schuberth, Amberg), um den Schleim und grobe Partikel zu entfernen. In einigen Experimenten wurden die adhärenten Zellen durch immunomagnetische Depletion von Lymphozyten (CD3, CD19, CD56) aufgereinigt. Die restlichen Zellen bestanden zu über 95 % aus Alveolarmakrophagen, wie durch α-Naphtyl-Azetat-Esterase Färbung (Sigma) gezeigt wurde.
Infektion mit M. tuberculosis
Makrophagen wurden mit M. tuberculosis (virulenter Stamm H37Rv) in einem Verhältnis von 5 Bakterien auf 1 Zelle (MOI 5) für vier Stunden infiziert wie beschrieben [10 11 M. tuberculosis
[7 Treponema pallidum für 48 Stunden koinkubiert. Gegebenfalls wurden den Ansätzen Inhibitoren der iNOS (L-NIL, L-NAME, oder D-NAME) zugegeben. Für die Blockierungsexperimente wurden M. tuberculosis -infizierte Zellen mit ihrem Liganden in der Gegenwart monoklonalen Antikörpern gegen TLR2 (10 µg/ml) [7 8
Immunhistochemie
Lymphknotenproben wurden von 5 Tuberkulosepatienten entnommen. Immunperoxidase Färbung wurde mit monoklonalen TLR2-Antikörpern durchgeführt wie beschrieben [12
Ergebnisse und Diskussion
Zunächst untersuchten wir, ob die Aktivierung von Mausmakrophagen durch bakterielle Lipoproteine die Überlebensfähigkeit von M. tuberculosis einschränkt. Das 19-kD-Lipoprotein von M. tuberculosis oder das Tp47-Lipopeptid von Treponema pallidum
[7 13 14 15 M. tuberculosis infizierte RAW-Zellen wurden mit dem 19-kD-Lipoprotein in der An- und Abwesenheit von pharmakologischen Inhibitoren der iNOS stimuliert und die Sekretion von NO sowie die antibakterielle Aktivität bestimmt. Wir fanden, dass die NO-Synthese in der Anwesenheit von L-N6 -Iminoethyl-Lysin (L-NIL) oder L-N6 - Nitro-Arginin-methylester (L-NAME) fast völlig unterdrückt wurde (Abb. [1a 1a
Um zu zeigen, dass die lipoproteininduzierte antimikrobielle Aktivität von der Aktivierung der TLR abhängt, untersuchten wir die Fähigkeit des 19-kD-Lipoproteins, in Peritonealmakrophagen von TLR2- oder TLR4-defizienten Mäusen eine antimikrobielle Aktivität zu induzieren. Die Experimente wurden mit nichtinfizierten und M. tuberculosis -infizierten (Abb. [1b 1b
Bislang ist unklar, ob humane Makrophagen antimikrobielle Aktivität durch NO vermitteln können. Wir wollten klären, ob die Stimulation von TLR zur NO-abhängigen Limitierung des mykobakteriellen Wachstums führt. Die Aktivierung humaner Monozyten mit bakteriellen Lipoproteinen reduzierte das intrazelluläre Wachstum von M. tuberculosis in vergleichbarem Ausmaß wie in Mausmakrophagen (Daten nicht gezeigt). Das Abtöten der intrazellulären Mykobakterien in humanen Monozyten war eindeutig abhängig von der 19-kD-vermittelten Aktivierung von TLR2, da monoklonale Antikörper gegen TLR2 [7 8 2a 2b 16 2b 2b 2b 2b 17 18 2c
Die Fähigkeit von Alveolarmakrophagen M. tuberculosis aufzunehmen und zu eliminieren stellt einen entscheidenden Abwehrmechanismus gegen Tuberkulose dar. Alveolarmakrophagen wurden aus der bronchoalveolären Lavage aufgereinigt, mit M. tuberculosis infiziert und mit dem 19-kD-Lipoprotein inkubiert. Nach 48 Stunden wurde die Anzahl lebendiger Mykobakterien bestimmt (Abb. [3a 19 3b
Über hunderte von Millionen Jahren der Evolution hat das Immunsystem die Struktur der TLR wie auch den NFkB-Signaltransduktionsweg als einen Abwehrmechanismus der angeborenen Immunantwort beibehalten, um der Bedrohung durch mikrobielle Krankheitserreger zu begegnen. Die geschilderten Ergebnisse zeigen, dass sowohl humane als auch Mauszellen den TLR-Signalweg benutzen, über den antimikrobielle Effektormechanismen stimuliert werden. Allerdings sind die Effektormoleküle unterschiedlich: Während in Mäusen TLR-Aktivierung zu einer NO-abhängigen antibakteriellen Aktivität führt, ist der TLR-vermittelte Abwehrmechanismus beim Menschen NO-unabhängig. Bei Drosophila führt die Aktivierung von Toll zur Produktion einer Vielzahl antimikrobieller Peptide, darunter Metchnikowan, Defensine, Cecropine, und Drosomycin [1 2 3 Drosophila deuten darauf hin, dass die Untersuchung der Induktion antimikrobieller Peptide in diesen Zellen fruchtbar sein kann. Erkenntnisse aus derartigen Studien ergeben neue Einblicke in die Immunantwort beim Menschen.
Abb. 1 Mikrobielle Lipoproteine inhibieren das Wachstum von M. tuberculosis.
(A ) Das 19-kD-Lipoprotein von M. tuberculosis vermittelt eine NO-abhängige antimikrobielle Aktivität in RAW-Zellen. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) wurde 48 Stunden nach Infektion mit einer MOI von 5 ermittelt. Die Inhibitoren (L-NIL, 1mM; L-NAME, 2mM) wurden direkt nach der Pulsinfektion zusammen mit dem 19-kD-Lipoprotein (1 µg/ml) zu den Zellen gegeben. Die Abbildungen zeigen den Durchschnitt ± SEM von drei oder mehr unabhängigen Experimenten.
(B ) Lipoproteininduziertes Abtöten von M. tuberculosis wird durch TLR2 vermittelt. Thioglykollatinduzierte Peritonealmakrophagen von Kontroll- (wt) und gendefizienten (TLR2 -/-) Mäusen wurden mit M. tuberculosis (MOI 5) infiziert. Die Produktion von NO (Griess Reaktion) und die Bakterienlast (Plattieren von Zell-Lysaten) wurde 48 Stunden nach der Zugabe des 19-kD-Lipoproteins (1 µg/ml) oder LPS (0,1 µg/ml) bestimmt. Die Abbildung zeigt den Durchschnitt aus Triplikaten eines Experimentes ± SEM.
Abb. 2 Humane Zellen töten M. tuberculosis über einen TLR2-abhängigen, aber NO-unabhängigen Mechanismus.
(A ) Die Inhibierung von mykobakteriellem Wachstum in humanen Monozyten wird durch die Anwesenheit blockierender Antikörper gegen TLR2 (αTLR2) gehemmt, ist aber unabhängig von der NO-Freisetzung. Infizierte Monozyten (MOI 5) wurden mit αTLR2 (10 µg/ml) oder L-NIL (1mM) für 48 Stunden inkubiert und das intrazelluläre Wachstum wurde durch das Plattieren von vier Verdünnungen der Zell-Lysate, jeweils in Duplikaten, bestimmt.
(B ) TNF und IFN-γ induzieren die Freisetzung von NO und antimikrobielle Aktivität in Mausmakrophagen, nicht aber in humanen Monozyten. TNF und IFN-γ (jeweils 10 ng/ml) wurden zu infizierten Mausmakrophagen (RAW) oder humanen Monozyten gegeben. Die Freisetzung von NO und die Bakterienlast wurden nach 48-stündiger Kultur bestimmt. Die Abbildungen zeigen den Durchschnitt von vier unabhängigen Experimenten ± SEM mit Zellen von verschiedenen Spendern.
(C ) Die antimykobakterielle Aktivität des 19-kD-Lipoproteins ist TNF-unabhängig. Das 19-kD-Lipoprotein (2 µg/ml) und Antikörper gegen TNF (20 µg/ml) wurden wie in der Beschriftung angegeben pipettiert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden lysiert und die Anzahl der CFU bestimmt.
Abb. 3 TLR2 wird am Ort der Tuberkulose-Infektion beim Menschen exprimiert.
(A ) Aktivierung von Alveolarmakrophagen durch das 19-kD-Lipoprotein reduziert das Überleben intrazellulärer Mykobakterien auf TLR2-abhängige, jedoch NO-unabhängige Weise. Alveolarmakrophagen wurden mit M. tuberculosis mit einer MOI von 2 für vier Stunden infiziert und danach das Lipoprotein (1 µg/ml) oder die Inhibitoren zugegeben. Das bakterielle Wachstum wurde nach 48 Stunden gemessen. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment mit Alveolarmakrophagen von vier unterschiedlichen Spendern. Die Daten sind als CFU ± SEM angegeben.
(B ) zeigt die TLR2-Expression im Gewebe von Patienten mit Lymphknoten-Tuberkulose. Die Immunperoxidase-Färbung zeigt Bilder (40fache Vergrößerung) mit TLR2-Expression in Rot auf großen, ovalen Zellen innerhalb der Granulome, welche typisch für Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie sind.
