Die molekulare Medizin befasst sich mit den Grundlagen des Lebens und seiner krankhaften Veränderungen. Sie verbindet die Inhalte und Fragestellungen der experimentellen Medizin mit der Methodik und den Techniken von Molekularbiologie, Zellbiologie, Proteinbiochemie und Genomik. Die dabei entscheidenden methodischen Grundlagen sind erst wenige Jahrzehnte alt. Angefangen hat die Entwicklung mit der ersten Isolierung eines Nukleoproteins im Jahr 1870. Doch erst seit verhältnismäßig kurzer Zeit stehen mit der DNA-Sequenzierung, der Polymerasekettenreaktion oder der Aufklärung des menschlichen Genoms Entdeckungen und Entwicklungen zur Verfügung, die zahlreiche diagnostische und therapeutische Möglichkeiten eröffnen.
Sowohl in der Diagnostik (Gendiagnostik, Pränataldiagnostik) als auch beim Einsatz von Therapeutika (rekombinant hergestellte Arzneimittel, Impfstoffe, Enzyme) haben sich große Fortschritte ergeben. Der direkte Einsatz molekularer Methoden in der Gentherapie oder Stammzelltherapie ist jedoch momentan erst in Ansätzen möglich. Um die therapeutischen Erfolgsaussichten dieser Verfahren zuverlässig bewerten zu können, bedarf es sicherlich noch erheblicher Anstrengungen in Forschung und Entwicklung.
Somatische Gentherapie
Somatische Gentherapie
Als Gentherapie versteht man das therapeutische Einbringen von Genen, Genabschnitten oder Oligonukleotiden in Zellen oder Gewebe. Die Expression und die Funktion des transfizierten Gens sollen wichtige Zellfunktionen wiederherstellen (z.B. Enzymtransfer bei Speicherkrankheiten) oder pathologische Mechanismen unterdrücken (z.B. Proliferation von Tumorzellen). Gegenwärtig werden zwei Prinzipien der Gentherapie verfolgt: Zum einen kann - mithilfe geeigneter Vektoren - genetisches Material direkt in die Zielzellen eingebracht werden (In-vivo-Gentherapie). Alternativ können dem Patienten Zellen entnommen werden, in die in Zellkultur (in vitro) genetisches Material eingeschleust wird. Anschließend werden die veränderten Zellen dem Patienten zurückgeben (Ex-vivo-Gentherapie) [Abb. 1
Ein weiteres Unterscheidungskriterium ist die Vererbbarkeit der genetischen Veränderung. So betrifft die somatische Gentherapie ausschließlich Körperzellen außerhalb der Keimbahn. Davon zu unterscheiden ist die mögliche „Keimbahntherapie”, bei der therapeutische Genkonstrukte in Keimzellen eingeschleust werden sollen, um Erbdefekte bereits vor ihrer Entstehung im Individuum zu beheben. Letzteres ist jedoch aufgrund medizinischer, ethischer und juristischer Bedenken beim Menschen in Deutschland unter anderem durch das Embryonenschutzgesetz verboten.
Bei der somatischen Gentherapie wird genetisches Fremdmaterial in periphere Körperzellen eingebracht. Um das Gen in die Zielzelle transportieren zu können, ist ein so genannter Vektor nötig. Idealerweise sollte dieser seine Zielzellen mit hoher Effizienz und möglichst spezifisch transfizieren. Zudem ist eine stabile Transfektion wünschenswert, da sonst keine dauerhafte Korrektur der Erkrankung möglich ist. Der verwendete Vektor muss dabei aber hohe Sicherheitsstandards erfüllen: So muss eine pathogene Wirkung weitgehend ausgeschlossen sein, insbesondere sollte er eine möglichst geringe Immunogenität besitzen.
Prinzipiell eignen sich virale und nichtvirale Vektoren für den Gentransfer, doch über 70 % der laufenden Gentherapiestudien verwenden virale Vektoren [Tab. 1
Um die geringe Selektivität der Transfektion für einzelne Zielgewebe oder Organe zu verbessern, wurde das so genannte „retargeting” entwickelt. Dazu werden gewebespezifische Liganden in die Virushülle eingebaut. Da diese spezifisch an Rezeptormoleküle bestimmter Gewebe oder Organe binden, bringen sie ihre Genladungen an den Zielort [5 7 Tabelle 2
Erste Therapieversuche
Erste Therapieversuche
Schon 1990 führten amerikanische Wissenschaftler an den „National Institutes of Health” die erste Gentherapie durch. Die Patientin war ein damals vierjähriges Mädchen, das an erblichem Adenosindesaminase(ADA)-Mangel, einem meist tödlich verlaufenden Immundefekt litt. Sie erhielt mittels Infusionen autologe T-Lmphozyten, in die durch einen viralen Gentransfer ex vivo ein normales, funktionsfähiges ADA-Gen eingebracht worden war. Da unter den gewählten Bedingungen die Expression des ADA-Gens nur über eine begrenzte Zeit stabil ist, müssen die Injektionen etwa alle vier Monate wiederholt werden. Davon abgesehen lebt die Patientin heute fast wie ein gesundes gleichaltriges Kind [2 12
Seit dieser Studie sind weltweit etwa 3500 Patienten in mehr als 600 Studien behandelt worden [1 Tab. 3
Tatsächlich gelang der Nachweis eines klinisch fassbaren Erfolges durch eine Gentherapie erst im Jahr 1999. Damals konnten Patienten mit X-chromosomal vererbter, schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID-X1) erfolgreich therapiert werden [3
Die behandelten Patienten (zehn Jungen im Alter von einem Monat bis etwa einem Jahr sowie ein Teenager mit partieller Immunschwäche) hatten keine HLA-identischen Verwandten - damit war eine klassische Therapie durch einen Knochenmarktransfer ausgeschlossen. Das therapeutische gc-Genkonstrukt wurde durch einen retroviralen Ex-vivo-Gentransfer in die CD34+-Zellen der Patienten eingeführt. Diese Behandlung erfolgte in einer sterilen Isolationsabteilung unter oraler antibiotischer Abdeckung und Immunglobulin-Infusion. Bereits drei Monate nach der Behandlung konnten die Patienten aus der Isolierstation entlassen werden. Die IgG- und IgM-Werte im Serum hatten sich normalisiert, ebenso wie Infektabwehr und Impfreaktionen [3
Leider wird das äußerst positive Bild der ersten Therapiestudien durch das Auftreten eines leukämieartigen, lymphoproliferativen Syndroms bei einem der zunächst sehr erfolgreich behandelten Kinder getrübt [6
Nicht nur die Therapie mit retroviralen Vektoren, sondern auch der somatische Gentransfer mittels adenoviraler Konstrukte ist mit erheblichen Risiken belastet. Vier Tage nachdem er im Rahmen einer Therapiestudie an der University of Pennsylvania mit rekombinanten adenoviralen Vektoren behandelt worden war, starb der 18-jährige Jesse Gelsinger, ein Patient mit partiellem Ornithin-Transcarbamylase- (OTC)-Mangel. Er hatte die höchste in der Studie verwendete Vektordosis erhalten (6 x 1011 Viruspartikel/kg Körpergewicht). Wie der klinische Verlauf zeigte und die Obduktion bestätigte, war eine überschießende systemische Immunreaktion auf den adenoviralen Vektor die Todesursache. Dieser Fall war äußerst tragisch: Der junge und weitgehend beschwerdefreie Patient war in die Therapiestudie aufgenommen worden, obwohl er die Einschlusskriterien nicht erfüllt hatte, da sein Ammoniak-Spiegel außerhalb der festgelegten Grenzwerte lag [16
Mittlerweile ist auch für die Hämophilie B eine erfolgreiche Gentherapiestudie veröffentlicht worden, die sich allerdings auf drei Patienten beschränkt [9 18
Therapie von Krebserkrankungen
Therapie von Krebserkrankungen
Während monogene Erkrankungen wie SCID-X1, ADA-Mangel, Hämophilie oder zystische Fibrose nur etwa ein Achtel aller Gentherapiestudien ausmachen [Tab. 4 14 15
Beim Prinzip des Tumor-Suizids dagegen wird ein Suizidgen in die Tumorzelle eingeschleust, um damit ein als nichttoxisches Prodrug systemisch applizierbares Medikament in eine toxische Substanz umzuwandeln. Damit soll das eingeschleuste Gen mittelbar zum Absterben der Tumorzellen führen. Ein Beispiel für diesen Therapieansatz ist die Umwandlung von 5-Fluorocytosin zu 5-Fluorouracil durch die Cytosindeaminase von E. coli.
Die Immunmodulation schließlich soll eine zelluläre Immunreaktion gegen maligne Geschwülste erzeugen. Ausgangspunkt ist die Annahme, dass die Manifestation eines Tumors Folge eines Versagens der Immunkontrolle ist. Eine verminderte oder fehlende Erkennung kann auf einem Verlust der Präsentation von Tumorantigenen oder verminderten Kostimuli beruhen. Die Behandlung zielt darauf ab, tumorantigenspezifische T-Zellen zu aktivieren und zu amplifizieren. Dazu werden den Patienten zunächst Tumorzellen entnommen, die im Labor bestrahlt werden, um ihre Proliferation zu hemmen. Zugleich werden diese Zellen in vitro so verändert, dass sie auf ihrer Oberfläche ein spezifisches Antigen tragen, das von der körpereigenen Immunabwehr gut erkannt wird. Anschließend werden diese modifizierten Zellen intradermal injiziert, um die gewünschte Immunantwort gegen den Tumor auszulösen.
Leider hat keines der vorgestellten Protokolle in den bisher veröffentlichten, noch frühen klinischen Studien (Phase I und II) eine deutliche klinische Aktivität dieser Therapieansätze bei Tumorerkrankungen gezeigt. Jede dieser Studien leistet jedoch einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Technologie. Es bleibt zu hoffen, dass der therapeutische Gentransfer in absehbarer Zeit für einzelne, spezifische Indikationen einen klinisch messbaren Erfolg hervorbringen wird.
Transfer von Stammzellen
Transfer von Stammzellen
Stammzellen sind nicht ausschließlich in embryonalem Gewebe zu finden - sondern auch in den Geweben des erwachsenen Menschen, die einem ständigen Umsatz unterliegen. So erneuert sich beispielsweise unsere Haut ständig, indem sich Stammzellen ihrer Keimschicht in zwei verschiedene Nachkommen teilen. Eine der beiden Tochterzellen reift zu einer Hautzelle aus und wandert dabei in Richtung der äußeren Hornschicht. Die undifferenzierte Tochterzelle dagegen setzt die sich andauernd teilende Stammzelllinie fort. Diese so genannte differenzielle Zellteilung sichert somit den physiologischen Umsatz und Erhalt des Gewebes.
Die Stammzelle der Haut kann man - auch wenn es diesen Begriff in der Fachsprache nicht gibt - als „unipotent” bezeichnen: Die Regenerationsfähigkeit des Gewebes beruht auf einem einheitlichen „Entwicklungsprogramm”, das die ausreifende Tochterzelle als Steuerungsmechanismus aus ihrem Genom abruft. Solche unipotenten Stammzellen der Haut können nur ein einziges Entwicklungsprogramm realisieren.
Demgegenüber sind die Stammzellen unseres blutbildenden Knochenmarks weitaus flexibler: Blutbildende Stammzellen sind Vorläufer der roten und der weißen Blutkörperchen sowie der Lymphozyten. Als „multipotente” Stammzellen erlauben sie ihren Nachkommen ein breiteres Differenzierungsspektrum. Sie sind damit Beispiele für adulte Stammzellen, die im Gewebe des Erwachsenen noch in geringer Anzahl vorhanden sind und über das volle Entwicklungspotenzial aller Zellarten dieses Gewebes verfügen. Zugleich sind diese Zellen aber soweit determiniert, dass sie nicht die Differenzierungsprogramme anderer Gewebe realisieren, sondern nur Teile ihres im Genom kodierten Potenzials abrufen können.
Die Transplantation von Vorläufer- oder Stammzellen des blutbildenden Knochenmarks ist bereits in den klinischen Alltag eingedrungen. Vor einer knochenmarkschädigenden Hochdosischemotherapie können Stammzellen aus dem Knochenmark eines Patienten gewonnen werden [19 8
Eine weitgehend oder sogar vollkommen undifferenzierte Stammzelle verfügt über das größte Differenzierungspotenzial. Die erste intakte Zelle in der Entwicklung des Menschen und der Säugetiere ist die Zygote, eine „totipotente” Ursprungszelle, die aus der Vereinigung von Ei und Samenzelle entsteht. Der frühe Embryo verliert seine Totipotenz nach ungefähr vier Tagen, kurz vor der Einnistung in die Gebärmutterschleimhaut. Zu diesem Zeitpunkt bildet sich die Blastozyste aus, deren Einzelzellen „pluripotent” sind. Sie können zwar noch verschiedene Gewebe, aber keinen vollständigen Embryo ausbilden [Tab. 5
Durch die molekularbiologische Aufklärung und rekombinante Herstellung der an der Differenzierung des frühen Embryos beteiligten Wachstumsfaktoren wurde es möglich, in diese Entwicklungsschritte steuernd einzugreifen. Während sich durch bestimmte Wachstumsfaktoren Differenzierungsschritte einleiten lassen, können entgegengesetzt wirkende Faktoren diese hinauszögern oder sogar ganz unterdrücken. Der entscheidende Fortschritt in der Stammzellbiologie bestand in der Entwicklung von embryonalen Stammzelllinien (ES-Zellen), die sich nicht ausdifferenzieren, sondern dauerhaft im frühen Zustand von Zellteilung und Totipotenz verharren. Der als rekombinantes Protein in großen Mengen herstellbare Wachstumsfaktor LIF („leukemia inhibitory factor”) hemmt den Übergang in spezifische Gewebe. Damit wurde es möglich, embryonale Stammzellen in Zellkulturen beliebig zu vermehren und erst durch Zugabe weiterer Wachstumsfaktoren ihre Differenzierung einzuleiten.
Transplantierte Stammzellen differenzieren sich entsprechend ihrer Gewebeumgebung und integrieren sich in die Funktion dieser Organe. Zwar sind diese Ansätze im Tierversuch bereits recht weit gediehen, doch der Anwendung beim Menschen stehen - neben ethischen Bedenken - auch die biologische Barriere unterschiedlicher Blut- und Gewebegruppen entgegen. Man hofft gegenwärtig, dieses Problem durch eine Reprogrammierung von Stammzellen lösen zu können.
Zu diesem Zweck sollen Zellkerne aus Körperzellen des Empfängers in entkernte Spendereizellen überführt werden, sodass die dadurch entstehenden künstlichen Zellen die Erbeigenschaften des Patienten tragen. Auch sie durchlaufen die dargestellten frühembryonalen Differenzierungsschritte, die durch Zugabe von Wachstumsfaktoren in Richtung des Gewebes gelenkt werden sollen, das beim Patienten ersetzt werden soll. Von einem therapeutischen Gewebeersatz werden dort medizinische Anwendungsmöglichkeiten erwartet, wo es zu einem krankheitsbedingten Untergang differenzierter Gewebe kommt. Als Indikationen sind unter anderem Krankheiten des Nervensystems wie Morbus Parkinson, amyotrophe Lateralsklerose und Schlaganfall, aber auch Mukoviszidose oder Herzinfarkt denkbar.
Aus ethischen Gründen ist die Erzeugung humaner embryonaler Stammzellen in Deutschland untersagt und ihre Verwendung gesetzlich stark eingeschränkt. Bis zu einer kürzlich erfolgten Positionsänderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft wurde zunächst die Verwendung adulter Stammzellen favorisiert, deren Entwicklungspotenzial jedoch unter dem embryonaler Stammzellen liegt. Erst eine Bewertung der Anwendungsmöglichkeiten von Stammzellen wird die Güterabwägung zwischen dem Schutz embryonaler Zellen und dem Anspruch schwer kranker Menschen auf bestmögliche Hilfe erlauben.
Ins Netz gegangen
Ins Netz gegangen
http://snp.cshl.org
Die SNP Consortium Ltd. ist eine gemeinnützige Organisation, welche Informationen über so genannte Single-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Verfügung stellt. Inzwischen hat sie bereits über 180000 SNPs entdeckt und charakterisiert. Über die Kenntnis dieser Genvariationen scheint es möglich zu sein, mehr über Pathomechanismen und spezielle Therapieregime bestimmter Erkrankungen zu erfahren. Die Website ist allgemein zugänglich und wird laufend aktualisiert.
http://www.dhgp.de
Die Struktur, Funktion und Regulation menschlicher Gene, besonders derjenigen mit medizinischer Relevanz, will das Deutsche Humangenomprojekt - in Kooperation mit den internationalen Anstrengungen - systematisch identifizieren und charakterisieren. Hier finden sich nicht nur Informationen zu den bislang durchgeführten und aktuell geförderten Projekten, sondern beispielsweise auch ein Lexikon der Genforschung oder eine Liste humangenetischer Beratungsstellen. Und auch allgemeine Links rund um die Genomforschung sind hier nachzuschlagen.
http://www.embl-heidelberg.de
Informationen rund um das „European Molecular Biology Laboratory” (EMBL) mit Sitz in Heidelberg finden Sie auf dieser Homepage. Hier stellen sich Forschungsgruppen und -programme vor und auch diverse Datenbanken sind hier verknüpft - ob zu Nukleotid- oder Proteinsequenzen, Daten zu makromolekularen Strukturen oder statistische und vergleichende Analysen des Proteoms voll sequenzierter Organismen. Verlinked sind zudem Tools zum Vergleich von DNA- oder Protein-Sequenzen.
http://www.biochem.uni-erlangen.de/MolMed/
Die Universität Erlangen bietet einen Diplomstudiengang „Molekulare Medizin” an, der die Fragestellungen der experimentellen Medizin mit den Methoden der Molekularbiologie verbinden und die Lücke zwischen dem klinisch orientierten Medizinstudium und den biowissenschaftlichen Studiengängen schließen möchte. Interessierte finden hier genauere Informationen über Aufbau und Konzept des Studiengangs sowie über die Zulassungsbedingungen.
Abb 1. Prinzipien der Gentherapie
Tab 1. Vektoren in Gentherapiestudien
Anzahl
prozentualer Anteil
virale Vektoren
70,3 %
Retrovirus
217
34,1 %
Adenovirus
171
26,9 %
Poxvirus
39
6,1 %
adenoassoziiertes Virus
15
2,4 %
Herpes-simplex-Virus
5
0,8 %
nichtvirale Vektoren
28,7 %
Lipofektion
77
12,1 %
nackte bzw. Plasmid-DNA
70
11 %
RNA-Transfer
6
0,9 %
Gene Gun
5
0,8 %
andere Transfektionsmethoden
25
3,9 %
Stand: Oktober 2002
mit freundlicher Genehmigung der Wiley Journal of Gene Medicine web site http://www.wiley.co.uk/genmed
Tab 2. Eigenschaften von Vektoren für den Gentransfer
Vektor
Applikation
Effizienz
Selektivität
Expression
viral
Retroviren
ex vivo
teilweise hoch
gering
stabil
Integration ins Genom zufällig
Adenoviren
in vivo und ex vivo
hoch
gering
vorübergehend
keine Integration ins Genom
adenoassoziierte Viren
in vivo und ex vivo
hoch
gering
stabil
Integration ins Genom in Anwesenheit des viralen rep-Gens spezifisch
nichtviral
Liposomen
in vivo und ex vivo
relativ gering
gering
vorübergehend
keine Integration ins Genom
nackte DNA (Plasmid) Gene Gun
in vivo und ex vivo
gering
gering
vorübergehend
keine Integration ins Genom
Tab 3. Klinische Gentherapiestudien
Studien
Anzahl
prozentualer Anteil
Phase I
420
66 %
Phase I/II
134
21,1 %
Phase II
73
11,5 %
Phase II/III
5
0,8 %
Phase III
4
0,6 %
Stand: Oktober 2002
Mit freundlicher Genehmigung der Wiley Journal of Gene Medicine web site http://www.wiley.co.uk/genmed
Tab 4. Klinische Gentherapiestudien
Anzahl
prozentualer Anteil
Genmarkierung (z.B. Vektorkontrolle)
49
7,7 %
Therapie
Krebs
403
63,4 %
monogene Krankheiten
(X-gebundenes SCID, SCID-ADA, Hunter-Syndrom, familiäre Hypercholesterinämie, zystische Fibrose, Hämophilie B, chronische granulomatöse Erkrankung, Ornithintranscarbamylase-Mangel)
78
12,3 %
Infektionskrankheiten (AIDS)
41
6,4 %
kardiovaskuläre Erkrankungen
51
8 %
andere (rheumatische Arthritis, gesunde Freiwillige)
14
2,2 %
Stand: Oktober 2002
Mit freundlicher Genehmigung der Wiley Journal of Gene Medicine web site http://www.wiley.co.uk/genmed
Tab 5. Übersicht über Stammzellen und Differenzierungspotenziale
Entwicklungsmöglichkeit
Beispiel
Zelltyp
unipotent
reife Zellen eines Zelltyps
äußere Haut
Keimschicht
multipotent
verschiedene Zelltypen eines Gewebes im adulten Organismus
blutbildendes Knochenmark
Stammzelle des Knochenmarks
pluripotent
Zelltypen verschiedener Gewebe
Embryoblasten
innere Zellmasse
totipotent
gesamter Organismus
Achtzellstadium
embryonale Stammzelle
