Kontrollierter Gentransfer in humane adulte mesenchymale Stammzellen mittels adenoviraler Vektoren

Zusammenfassung

Studienziel: Der adenoviral vermittelte Gentransfer bleibt ein wichtiges Instrument für die Grundlagenforschung. Unsere Hypothese lautete: Die adenovirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) in vitro kann durch eine kontrollierte Anwendung der Parameter Viruslast (MOI) und Expositionsdauer verbessert werden. Methode: Um unsere Hypothese zu testen, wurden hMSC mit adenoviralen Vektoren für Luciferase und BMP-2 transduziert. Verschiedene MOI und Expositionszeiten wurden angewandt, die Produktion des Transgens und Gesamtproteingehalt wurden bestimmt. Um die praktische Relevanz zu beurteilen, quantifizierten wir die mRNA der Knochenmarkergene Typ-1-Kollagen und Runx2 mittels quantitativer real-time PCR. Als phänotypischen Knochenmarker bestimmten wir die alkalische Phosphataseaktivität. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse und Post-hoc-Tests (p < 0,05). Ergebnisse: Längere Exposition führte zu abnehmenden Mengen des Transgens und des Gesamtproteingehaltes. Eine zunehmende MOI hatte bei Exposition bis zu 4 Stunden einen Anstieg der Transgenproduktion zur Folge. Der Transfer des BMP-2-Gens führte zu osteoblastärer Differenzierung als Hinweis auf die biologische Aktivität des Transgens. Schlussfolgerung: Die Expositionsdauer ist für die Toxizität von entscheidender Bedeutung und sollte für hMSC 4 Stunden nicht überschreiten. Obwohl zunehmende Expositionsdauer zum Zelluntergang führt, scheinen dies die überlebenden Zellen über eine gesteigerte Produktion des Transgens teilweise kompensieren zu können. Hieraus ergibt sich, dass die Transduktionseffizienz nicht eindeutig nach einem Ja-oder-Nein-Schema beurteilt werden kann.

Abstract

Aim: Adenoviral gene transfer remains a powerful tool for basic research purposes. We hypothesize that adenoviral transduction of human mesenchymal stem cells (hMSC) in vitro can be improved by refined use of experimental parameters. Methods: hMSCs were transduced by adenoviral vectors encoding Luciferase or BMP-2 at a selection of multiplicities of infection (MOI) and exposure times. Transgene production and total protein content were measured. To determine practical relevance, expression of the bone marker genes Runx2 and Type I collagen was analyzed by quantitative PCR. As a phenotypic marker alkaline phosphatase was assessed. ANOVA and post hoc statistical analyses were used to determine differences among data (p < 0.05). Results: Prolonged exposure led to a decrease in transgene production and total protein content. Increasing MOI at exposure of up to 4 hours resulted in a higher production of the transgene. Transfer of the hBMP-2 gene promoted an enhanced lineage progression to the osteoblast phenotype indicating biological activity. Conclusion: Time of exposure is of major importance for toxicity in vitro and should not exceed 4 hours for hMSC. While increase in exposure time leads to cell death, surviving cells, up to a certain limit, seem to compensate by increasing production of the transgene indicating that transduction efficiency cannot be positively measured in a binary yes-or-no scheme.

humane mesenchymale Stammzellen - adenovirale Transduktion - BMP-2 - osteoblastäre Differenzierung - quantitative real-time PCR

Human mesenchymal stem cells - adenoviral transduction - BMP-2 - osteoblastic differentiation - quantitative real-time PCR

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