Epitope mapping of the human TSH receptor; Structure function studies

Summary

With the aid of recombinant DNA technology (PCR/site directed mutagenesis, sequencing) the full length coding region of the human TSH receptor was manipulated to place a specific epitope peptide tag (FLAG epitope sequence) at the carboxyl end of the protein. The resulting construct was cloned into a eukaryotic expression vector and stably transfected into HeLa cells. The expression/translation of the tagged TSH receptor molecule was monitored by immune-precipitation and western blotting of protein lysates, and was found to be expressed at considerable levels using the commercially available antibodies directed towards the FLAG epitope. This analysis revealed two discrete specific bands 90–120 KDa representing, presumably, differently glycosylated forms of the receptor.

TSH radio receptor assays demonstrated that the FLAG tagged TSH receptor bound TSH comparable with the wild type receptor. Furthermore TSH stimulated cAMP response in these transfected cells were comparable to the wild type receptor, thus demonstrating that the tagged receptor was functionally identical to the transfected wild type receptor. These cell lines will be of great value when analysing TSH/receptor or receptor/ autoantibody interactions considering the availability of well characterized experimental anti-TSH receptor sera.

Zusammenfassung

Mit Hilfe von „molekularbiologischen Techniken (Polymerase-Kettenreaktion, ortsspezifische Muta-genese, DNA-Sequenzierung) wurde die vollständige kodierende Region des menschlichen TSH-Rezeptors am carboxy-terminalen Ende des Proteins durch Anfügen eines Markerpep-tids, dem sogenannten „Flag-Epitope”, modifiziert. Die Expression des markierten TSH-Rezeptormoleküls wurde durch Immunopräzipitation und „Western-Blotting” von Proteinlysaten transfizierter Zellen untersucht und beträchtliche Mengen des Rezeptors konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen das Flag-Epitop nachgewiesen werden. Auf diese Weise wurden zwei spezifische Moleküle von 90 bzw. 120 KDa Molekulargewicht gefunden, die wahrscheinlich verschieden glykolisierte Formen des TSH-Rezeptors darstellen.

Bindungsstudien mit radioaktiv markiertem TSH zeigten, daß der Flag-modifizierte TSH-Rezeptor ähnliche Bindungseigenschaften wie der Wildtyp-Rezeptor aufwies. Auch die cAMP Antwort nach Stimulation mit TSH war vergleichbar mit der Wild-Typ-Antwort, so daß unser markierter Rezeptor sich funktionell identisch zu einem transfizierten TSH-Rezeptor verhält. Diese durch Transfektion und Selektion etablierten Zellinien werden von großem Nutzen sein, um TSH-Rezepto-ren- bzw. Rezeptor-Autoantikörper-Interaktionen zu untersuchen, besonders unter Berücksichtigung der großen Zahl verfügbarer gut charakterisierter Anti-TSH-Rezeptor-Seren.

Key words

TSH receptor - epitope tagging - western blotting - immune precipitation